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    本發明係關於成纖維細胞生長因子21(FGF21)之具有經改良醫藥性質之新穎多肽及蛋白質變體的鑑別。本發明亦揭示治療包括代謝病況在內之FGF21相關病症之方法。
    公开号:TW201302782A
    申请号:TW100142397
    申请日:2011-11-18
    公开日:2013-01-16
    发明作者:Brian R Boettcher；Shari L Caplan；Douglas S Daniels；Bernhard H Geierstanger；Norio Hamamatsu；Stuart Licht；Andreas Loew；Stephen Craig Weldon
    申请人:Novartis Ag；Irm Llc；
    IPC主号:A61K38-00
    专利说明:
    治療FGF-21-相關病症之方法
    本發明係關於成纖維細胞生長因子21(FGF21)之具有經改良醫藥性質之新穎多肽。本發明亦揭示治療FGF21相關病症及降低重症病患者之死亡率及發病率之方法，該等FGF21相關病症係(例如)肥胖症、1型及2型糖尿病、胰腺炎、異常血脂症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症候群及其他代謝障礙。
    成纖維細胞生長因子(FGF)家族之特徵在於22個遺傳上不同之同源配體，其分為7個亞族。根據已公開文獻，FGF家族現由至少23個成員(FGF-1至FGF-23)組成(Reuss等人，Cell Tissue Res. 313:139-157(2003))。
    自小鼠胚胎分離FGF-21且其最接近FGF-19及FGF-23。此FGF亞族調節經典FGF所罕見之多種生理過程，亦即能量及膽汁酸穩態、葡萄糖及脂質代謝及磷酸鹽以及維生素D穩態。此外，與經典FGF不同，此亞族以內分泌方式作用。(Moore,D.D.(2007) Science 316,1436-8)。已報導，成纖維細胞生長因子21(FGF21)優先在肝中表現(Nishimura等人，Biochimica et Biophysica Acta,1492:203-206,(2000)；專利公開案WO 01/36640；及專利公開案WO 01/18172)且描述為治療缺血性血管疾病、傷口癒合及與肺、枝氣管或肺泡細胞功能喪失相關之疾病及很多其他病症。
    已將FGF21鑑別為有效代謝調節劑。將FGF21全身性投與患有膳食誘導性或遺傳性肥胖症及糖尿病之齧齒類動物及恒河猴可施加強的抗高血糖及降甘油三酯效應並減小體重。(Coskun,T等人(2008) Endocrinology 149:6018-6027；Kharitonenkov,A等人(2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635；Kharitonenkov,A等人(2007) Endocrinology 148:774-781；Xu,J等人(2009) Diabetes 58:250-259)。FGF21係209個胺基酸之多肽，其含有28個胺基酸之前導序列。人類FGF21與小鼠FGF21具有約79%胺基酸一致性且與大鼠FGF21具有約80%胺基酸一致性。
    儘管FGF-21活化FGF受體及下游信號傳導分子(包括FRS2a及ERK)，但尚未檢測出FGFR與FGF-21之直接相互作用。此外，各種非脂肪細胞不會對FGF-21作出反應，即使其表現多種FGFR異構形式。所有該等數據皆表明，輔因子必須經由FGFR來調介FGF-21信號傳導。最近研究已將在肝、脂肪細胞及胰腺中高度表現之β-可羅素(β-klotho)鑑別為對FGF-21作出細胞反應之決定因子(Kurosu,H.等人(2007) J Biol Chem 282,26687-95)。β-可羅素優先結合FGFR1c及FGFR4。β-可羅素-FGFR複合物而非單獨FGFR在活體外結合FGF-21(Kharitonenkov,A.等人(2008) J Cell Physiol 215,1-7)。已在FGF-23-可羅素-FGFR系統中鑑別相似機制(Urakawa,I.等人(2006) Nature 444,770-4)。
    首先在小鼠3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取分析中鑑別FGF-21之生物活性(Kharitonenkov,A.等人(2005) J Clin Invest 115,1627-35)。隨後，顯示FGF-21誘導胰島素獨立性葡萄糖攝取及GLUT1表現。亦已顯示，FGF-21改善多種糖尿病齧齒類動物模型中之高血糖症。另外，發現過度表現FGF-21之轉基因小鼠可抵抗膳食誘導性代謝異常，包括降低之體重及脂肪質量及胰島素敏感性之增強(Badman,M.K.等人(2007) Cell Metab 5,426-37)。將FGF-21投與糖尿病非人類靈長類動物可引起空腹血糖、甘油三酯、胰島素及升糖素(glucagon)含量下降，並顯著改良脂蛋白輪廓，包括HDL膽固醇之近80%增加(Kharitonenkov,A.等人(2007) Endocrinology 148,774-81)。重要地，在此NHP研究期間之任一點皆未觀察到低血糖症。此外，最近研究將FGF-21鑑別為重要的內分泌激素，其幫助控制對空腹狀態之適應。此可在PPARα下游提供先前缺失之連接，藉此肝與機體其餘部分通信以調節能量穩態之生物學。
    FGF-21調節脂肪(脂肪分解)、肝(脂肪酸氧化及酮體生成)及腦(遲鈍)之組合觀察將其確定為對空腹作出反應之主要內分泌調節劑(Kharitonenkov,A.及Shanafelt,A.B.(2008) BioDrugs 22,37-44)。然而，使用FGF-21直接作為生物治療劑之問題係其半衰期極短。在小鼠中，人類FGF21之半衰期係0.5小時至1小時，且在食蟹猴中，半衰期係2小時至3小時。
    在研發用作治療1型及2型糖尿病及其他代謝病況之治療劑之FGF21蛋白質時，將期望延長半衰期及提高穩定性。半衰期延長且穩定性提高之FGF21蛋白質將允許向所投與患者較少頻率地給予該蛋白質。明顯地，需要為治療性蛋白質FGF21研發穩定水性蛋白質調配物。
    FGF21可用作多用途無菌醫藥調配物。然而，已確定在該等條件下，防腐劑(即間甲酚)對FGF21之穩定性具有不良效應。本發明利用本發明之FGF21變體克服物理不穩定性之重大障礙，該等變體在醫藥調配物條件下比野生型FGF21更穩定，更不易發生蛋白質水解及酶促降解且更不可能聚集並形成複合物。
    因此，本發明之FGF21變體提供穩定藥理蛋白質調配物，其可用於治療FGF21相關病症，例如肥胖症、2型糖尿病、1型糖尿病、胰腺炎、異常血脂症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症候群、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎臟疾病、糖尿病併發症、神經病變、胃輕癱及其他代謝障礙；及降低重症病患者之死亡率及發病率。
    本發明係關於鑑別成纖維細胞生長因子21(FGF21)之新穎多肽及蛋白質變體，其具有經改良醫藥性質，例如在醫藥調配物條件下比野生型FGF21更穩定，更不易發生蛋白質水解及酶促降解且更不可能至聚集並形成複合物。本文亦揭示治療包括代謝病況在內之FGF21相關病症之方法。
    本發明之FGF21蛋白質變體可作為每週一次之可注射物單獨使用或與口服抗糖尿病劑組合使用，該等口服抗糖尿病劑可改良1型及2型糖尿病患者之升糖控制、體重及脂質輪廓。在第一態樣中，本發明提供成纖維細胞生長因子21(FGF21)之多肽及蛋白質變體，其包括(但不限於)表1中所列示且本文進一步闡述之序列中之一或多者。表1之該等FGF21變體包含具有多種位點特異性內部修飾之4個胺基酸之N-端截短成熟FGF21野生型蛋白質(即，4個殘基之N-端截短形式之成熟FGF21序列(SEQ ID NO:3))。相對於全長FGF21蛋白質序列(NCBI參考序列編號NP_061986.1)將表1之變體編號；例如，變體1(SEQ ID NO:5)之1位中之天冬胺酸殘基對應於SEQ ID NO:1之殘基編號33(及成熟FGF21序列(SEQ ID NO:3)之殘基編號5)。 表1.　FGF21變體、胺基酸序列及相對於野生型FGF21(SEQ ID NO:1)之胺基酸變化之列表



    其他實施例係關於本發明之多肽及蛋白質變體之多核苷酸編碼、含有該等多核苷酸之載體及帶有該載體之宿主細胞。
    本文提供用於產生該等多肽及蛋白質變體之方法，其中此等方法涉及經由(例如)截短野生型FGF21蛋白質及在野生型FGF21蛋白質內所關注位置處位點特異性納入胺基酸來修飾野生型FGF21蛋白質。該等修飾可相對於野生型FGF21蛋白質增強本發明變體之生物學性質，且在一些情形下，用作(例如)標籤及蛋白質半衰期延長劑之附接點，及用於將該等變體黏附至固體載體之表面之目的。本發明之有關實施例係產生細胞之方法，該等細胞能夠產生該等多肽及蛋白質變體，且能夠產生含有編碼該等變體之DNA之載體。
    在各實施例中，本文所揭示之多肽及蛋白質變體可包含(a)不超過8個胺基酸殘基之胺基端截短，其中該多肽能夠降低哺乳動物之血糖；(b)不超過12個胺基酸殘基之羧基端截短，其中該多肽能夠降低哺乳動物之血糖；或(c)不超過8個胺基酸殘基之胺基端截短及不超過12胺基酸殘基之羧基端截短，其中該多肽能夠降低哺乳動物之血糖。
    在一些實施例中，無論在相對於野生型FGF21作出之位點特異性胺基酸修飾之位置，還是在與野生型FGF21通常共有之胺基酸處，本文所揭示之多肽及蛋白質變體可共價連接至一或多種聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或多唾液酸。在其他實施例中，本發明多肽可視情況經由連接體(例如GS或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:4))融合至異源胺基酸序列。異源胺基酸序列可為IgG恆定結構域或其片段(例如，Fc區域)、人類血清白蛋白(HSA)或結合白蛋白之多肽。本文所揭示之此等融合多肽亦可形成多聚體。
    在一些實施例中，融合異源胺基酸序列(例如，HSA、Fc等)係融合至本發明蛋白質變體之胺基端。在其他實施例中，融合異源胺基酸序列(例如，HSA、Fc等)係融合至本發明蛋白質變體之羧基端。
    再一實施例係關於治療展現一或多種FGF21相關病症之患者之方法，該等病症係(例如)肥胖症、2型糖尿病、1型糖尿病、胰腺炎、異常血脂症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症候群、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎臟疾病，糖尿病併發症、神經病變、胃輕癱及其他代謝障礙，該方法包含向該需要此治療之患者投與治療有效量之一或多種本發明之人類FGF21多肽及蛋白質變體或其醫藥組合物。
    本發明亦提供醫藥組合物，其包含本文所揭示之多肽及蛋白質變體及醫藥上可接受之調配劑。此等醫藥組合物可在方法中用於治療代謝障礙，且該方法包含向有需要之人類患者投與本發明醫藥組合物。可治療之代謝障礙之非限制性實例包括1型及2型糖尿病及肥胖症。
    本發明之以下詳細說明將闡明本發明之該等及其他態樣。
    研發諸如FGF21(包括本發明之FGF21蛋白質變體)等蛋白質醫藥製劑之巨大挑戰係應對其物理及化學不穩定性。蛋白質之組成多樣性及特性界定特定行為，例如摺疊、構象穩定性及展開/變性。在利用蛋白質水溶液研究醫藥調配物條件時，必須解決此等特性以穩定蛋白質(Wang,W.,Int. J. of Pharmaceutics,18,(1999))。穩定所關注治療性蛋白質(例如本發明之FGF21蛋白質變體)之期望效應係提高對蛋白質水解及酶促降解之耐性，藉此改良蛋白質穩定性並減少蛋白質聚集。
    特定而言，在醫藥蛋白質研發中，抗微生物防腐劑(例如苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、間苯二酚及苯甲醇)係意欲為無菌、多用途調配物之非經腸醫藥調配物所必需的。不幸的是，該等化合物經常尤其不利地影響蛋白質產物之穩定性，從而觸發締合及聚集(Maa等人，Int. J. of Pharmaceutics 140:155-168(1996)；Lam等人，Pharm. Res. 14(6):725-729(1997))。
    本發明之FGF21多肽及蛋白質變體代表全長、野生型FGF21多肽之修飾形式，如業內已知。FGF21野生型序列可用作參考序列(SEQ ID NO:1)，例如，當需要在FGF21野生型序列與蛋白質變體之間進行比較時。FGF21野生型序列具有NCBI參考序列編號NP_061986.1，且可參見頒予Chiron公司之授權專利，例如US 6,716,626B1。

    編碼全長FGF21多肽(NCBI參考序列編號NM_019113.2)之對應cDNA序列展示如下(SEQ ID NO:2)

    成熟FGF21序列缺乏前導序列且亦可包括對多肽之其他修飾，例如胺基端(具有或不具有前導序列)及/或羧基端之蛋白質水解加工、自較大前體解離較小多肽、N-連接及/或O-連接之糖基化及熟習此項技術者所瞭解之其他轉譯後修飾。n熟FGF21序列之代表性實例具有以下序列(SEQ ID NO:3，其代表全長FGF21蛋白質序列(NCBI參考序列編號NP_061986.1)之胺基酸位置29-209)：

    編碼成熟FGF21多肽(SEQ ID NO:3)之對應cDNA序列展示如下(SEQ ID NO:47)：

    熟習蛋白質表現技術者應認識到，可在任一FGF21蛋白質變體之N-端引入甲硫胺酸或甲硫胺酸-精胺酸序列，用於在大腸桿菌(E. coli)中表現，且其涵蓋於本發明上下文內。
    術語「FGF21蛋白質變體」、「人類FGF21變體」、「FGF21多肽或蛋白質變體」、「變體」、「FGF21突變體」或任何相似術語定義為包含人類FGF21，其中天然(即，野生型)FGF21胺基酸序列已經修飾，例如，其中野生型蛋白質之至少一個胺基酸已經另一胺基酸取代及/或去除。另外，變體可相對於野生型FGF21蛋白質包括N-及/或C-端截短。一般而言，變體具有野生型蛋白質之一些經修飾結構或功能性質。舉例而言，變體可具有增強或改良之物理穩定性(在濃縮溶液中)(例如，較少疏水性調介之聚集)、增強或改良之血漿穩定性(當與血漿一起培育時)或增強或改良之生物活性，同時維持有利的生物活性特徵。
    可接受之胺基酸取代及修飾(構成本發明之FGF21多肽及蛋白質變體與野生型FGF21之差異)包括(但不限於)一或多個胺基酸取代(包括用非天然胺基酸類似物取代)及截短。因此，FGF21蛋白質變體包括(但不限於)定點FGF21突變體、截短之FGF21多肽、耐蛋白質水解之FGF21突變體、減少聚集之FGF21突變體、FGF21組合突變體及FGF21融合蛋白質，如本文所述。
    變體可具有增加之與醫藥防腐劑(例如，間甲酚、苯酚、苯甲醇)之相容性，從而使得可製備在儲存期間維持蛋白質之生理化學性質及生物學活性的經防腐處理之醫藥調配物。因此，相對於野生型FGF21具有增強之醫藥穩定性之變體在生理與經防腐處理之醫藥調配物條件下在濃縮溶液中具有經改良之物理穩定性，同時維持生物學效能。作為非限制性實例，本發明變體與其野生型對應部分相比可更耐蛋白質水解及酶促降解；可具有經改良之穩定性；且可更不可能聚集。本文所用該等術語不具有互斥性或限制性，給定變體完全可能具有野生型蛋白質之一或多種經修飾性質。
    本發明亦涵蓋編碼FGF21多肽或蛋白質變體、或包含與胺基酸序列SEQ ID NO:3至少約95%(或者96%、或者97%、或者98%、或者99%)一致之胺基酸序列之變體的核酸分子，但其中賦予FGF21蛋白質變體期望性質(例如，耐蛋白質水解性、延長半衰期或減少聚集之性質及其組合)之特定殘基尚未經進一步修飾。換言之，除FGF21突變體序列中已經修飾以賦予耐蛋白質水解性、減少聚集之性質或其他性質之殘基外，FGF21突變體序列中所有其他胺基酸殘基之約5%(或者4%、或者3%、或者2%、或者1%)可經修飾。此等FGF21突變體具有野生型FGF21多肽之至少一種活性。
    本發明亦涵蓋包含與核苷酸序列SEQ ID NO:47至少約95%(或者96%、或者97%、或者98%、或者99%)一致之核苷酸序列的核酸分子，但其中編碼賦予所編碼FGF21蛋白質變體耐蛋白質水解性、減少聚集之性質或其他性質之胺基酸殘基的核苷酸尚未經進一步修飾。換言之，除編碼FGF21突變體序列中已經修飾以賦予蛋白質水解性、減少聚集之性質或其他性質之殘基核苷酸外，FGF21突變體序列中所有其他核苷酸之約5%(或者4%、或者3%、或者2%、或者1%)可經修飾。此等核酸分子編碼具有野生型FGF21多肽之至少一種活性之FGF21突變體多肽。
    本文提供用於產生本發明之FGF21多肽及蛋白質變體之方法，其中此等方法涉及經由(例如)截短野生型FGF21蛋白質及在野生型FGF21蛋白質內所關注位置處位點特異性納入胺基酸來位點特異性修飾野生型FGF21蛋白質。該等修飾可相對於野生型FGF21蛋白質增強本發明變體之生物學性質，且在一些情形下，用作(例如)標籤及蛋白質半衰期延長劑之附接點，及用於將該等變體黏附至固體載體之表面之目的。本發明之有關實施例係產生細胞之方法，該等細胞能夠產生該等多肽及蛋白質變體，且能夠產生含有編碼該等變體之DNA之載體。
    在某些實施例中，使用此等位點特異性修飾將聚(乙二醇)(PEG)附接至蛋白質、多肽、及/或肽。在其他實施例中，使用此等位點特異性修飾將PEG-膽固醇偶聯物(包括微胞及脂質體)附接至蛋白質、多肽及/或肽。在其他實施例中，使用此等位點特異性修飾將糖(糖基化)附接至蛋白質、多肽及/或肽。
    在其他實施例中，使用此等位點特異性修飾作為附接手段用於產生FGF21野生型及/或變體多聚體，例如，二聚體(同源二聚體或異源二聚體)或三聚體。該等多聚體FGF21分子另外可附接有諸如PEG、糖及/或PEG-膽固醇偶聯物等基團或在胺基端或羧基端融合至其他蛋白質(例如Fc、HSA等)。
    在其他實施例中，使用此等位點特異性修飾來產生蛋白質、多肽及/或肽，其中位點特異性納入之吡咯離胺酸(pyrrolysine)或吡咯離胺酸類似物之位置允許將此等蛋白質、多肽及/或肽受控定向及附接至固體載體之表面上或附接有諸如PEG、糖及/或PEG-膽固醇偶聯物等基團。
    在其他實施例中，使用此等位點特異性修飾來位點特異性地交聯蛋白質、多肽及/或肽，藉此形成異源寡聚體，包括(但不限於)異源二聚體及異源三聚體。在其他實施例中，使用此等位點特異性修飾來位點特異性地交聯蛋白質、多肽及/或肽，藉此形成蛋白質-蛋白質偶聯物、蛋白質-多肽偶聯物、蛋白質-肽偶聯物、多肽-多肽偶聯物、多肽-肽偶聯物或肽-肽偶聯物。
    定義
    此文件中使用多個定義。大部分詞語具有熟習此項技術者賦予該等詞語之含義。下文或此文件中他處特別定義之詞語總體上具有本發明上下文中提供的含義且如熟習此項技術者通常所理解之含義。
    本文所用術語「FGF21」係指成纖維細胞生長因子(FGF)蛋白質家族之一個成員。FGF21之胺基酸序列(GenBank登錄號NP_061986.1)係如SEQ ID NO:1所述，其對應多核苷酸序列係如SEQ ID NO:2(NCBI參考序列編號NM_019113.2)所述。
    本文所用術語「FGF21受體」係指FGF21之受體(Kharitonenkov,A等人(2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7；Kurosu,H等人(2007) JBC 282:26687-26695；Ogawa,Y等人(2007) PNAS 104:7432-7437)。
    術語「FGF21多肽」係指在人類中表現之天然多肽。出於本發明之目的，術語「FGF21多肽」可互換使用，其係指任一全長FGF21多肽，例如，SEQ ID NO:1，其由209個胺基酸殘基組成且由核苷酸序列SEQ ID NO:2編碼；該多肽之任一成熟形式，其由181個胺基酸殘基組成，且其中已去除全長FGF21多肽之胺基端處之28個胺基酸殘基(即，其構成信號肽)；及其變體。
    術語「分離核酸分子」係指本發明核酸分子，其(1)已與當自源細胞分離總核酸時所一起天然發現之蛋白質、脂質、碳水化合物或其他材料之至少約50%分開，(2)不連接至全部或一部分「分離核酸分子」在自然界中所連接之多核苷酸上，(3)可操作地連接至自然界中不連接之多核苷酸上，或(4)在自然界中不作為較大多核苷酸序列之一部分存在。較佳地，本發明之分離核酸分子實質上不含任何其他污染性核酸分子或在其天然環境中發現的其他污染物，該等污染物會干擾本發明之分離核酸分子在多肽產生中之用途或其治療性、診斷性、預防性或研究用途。
    術語「載體」用於指用於將編碼資訊轉移至宿主細胞之任一分子(例如，核酸、質粒或病毒)。
    術語「表現載體」係指適於轉形宿主細胞且含有引導及/或控制所插入異源核酸序列表現之核酸序列的載體。若存在內含子，則表現包括(但不限於)諸如轉錄、轉譯及RNA剪接等過程。
    本文所用術語「可操作地連接」係指側翼序列之佈置，其中所述側翼序列經組態或組裝以實施其一般功能。因此，可操作地連接至編碼序列之側翼序列能夠達成編碼序列之複製、轉錄及/或轉譯。舉例而言，編碼序列可操作地連接至啟動子，此時該啟動子能夠引導該編碼序列轉錄。側翼序列無需與編碼序列鄰接，只要其正確發揮作用即可。因此，舉例而言，在啟動子序列與編碼序列之間可存在尚未轉譯之插入轉錄序列，且該啟動子序列仍可視為「可操作地連接」至該編碼序列。
    所用術語「宿主細胞」係指已經轉形或能夠用核酸序列轉形且隨後表現所選所關注基因之細胞。該術語包括親本細胞之子代，而無論子代在形態上或遺傳組成上是否與原始親本相同，只要存在所選基因即可。
    本文所用術語「胺基酸」係指天然胺基酸、以與天然胺基酸相似之方式發揮作用之非天然胺基酸、胺基酸類似物及胺基酸模擬物，該等胺基酸皆呈其D及L立體異構體，若其結構允許此等立體異構體形式。胺基酸在本文中以其名稱、其習知三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦之單字母符號提及。
    術語「天然」在結合諸如核酸分子、多肽、宿主細胞及諸如此類等生物學材料使用時，係指在自然界發現且未經人操作之材料。類似地，本文所用「非天然」係指在自然界中未發現或已由人進行結構修飾或合成之材料。在結合核苷酸使用時，術語「天然」係指鹼基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)。在結合胺基酸使用時，術語「天然」係指20種習用胺基酸(即，丙胺酸(A)、半胱胺酸(C)、天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、組胺酸(H)、異白胺酸(I)、離胺酸(K)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、天冬醯胺酸(N)、脯胺酸(P)、麩醯胺酸(Q)、精胺酸(R)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、纈胺酸(V)、色胺酸(W)及酪胺酸(Y))以及硒半胱胺酸(selenocysteine)、吡咯離胺酸(PYL)及吡咯啉-羧基-離胺酸(PCL)。
    吡咯離胺酸(PYL)係在甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)家族之產甲烷古菌(methanogenic archaea)之甲胺甲基轉移酶天然發現的胺基酸。吡咯離胺酸係以框內UAG密碼子在各別mRNA中以共轉譯方式納入之離胺酸類似物，且將其視為第22種天然胺基酸。
    至少如PCT專利公開案WO 2010/48582(申請者IRM,LLC)中所述，嘗試在大腸桿菌中生物合成吡咯離胺酸(PYL)導致形成本文中稱作吡咯啉-羧基-離胺酸或PCL之「去甲基化吡咯離胺酸」。本文所用「PCL」係指PCL-A或PCL-B。
    本文所用術語「非天然胺基酸(non-natural amino acid及unnatural amino acid)」意欲可互換地代表不能使用來自任一有機體之未經修飾或經修飾基因以生物合成方式在任一有機體中產生之胺基酸結構，無論相同或不同。該等術語係指天然(野生型)FGF21蛋白質序列或本發明FGF21變體之序列中不存在之胺基酸殘基。其包括(但不限於)不為20種天然胺基酸、硒半胱胺酸、吡咯離胺酸(PYL)或吡咯啉-羧基-離胺酸(PCL)中之一者的經修飾之胺基酸及/或胺基酸類似物。可藉由取代天然胺基酸及/或藉由將非天然胺基酸插入天然(野生型)FGF21蛋白質序列或本發明FGF21變體之序列中來引入此等非天然胺基酸殘基。亦可納入非天然胺基酸殘基，以使FGF21分子具有期望功能，例如，連接功能部分(例如，PEG)之能力。
    另外，應理解，將此等「非天然胺基酸」納入蛋白質中需要經修飾tRNA及經修飾tRNA合成酶(RS)。該等「所選」正交tRNA/RS對係藉由如由Schultz等人研發之選擇方法或藉由隨機或靶向突變來產生。舉例而言，吡咯啉-羧基-離胺酸係「天然胺基酸」，此乃因其係藉由自一個有機體轉移至宿主細胞中之基因以生物合成方式產生，且由於其係藉由使用天然tRNA及tRNA合成酶基因納入蛋白質中，而對胺基苯丙胺酸(參見，Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code,Mehl RA,Anderson JC,Santoro SW,Wang L,Martin AB,King DS,Horn DM,Schultz PG. J Am Chem Soc.2003年1月29日；125(4):935-9))係「非天然胺基酸」，此乃因其儘管係以生物合成方式產生，但係藉由「所選」正交tRNA/tRNA合成酶對納入蛋白質中。
    經修飾編碼胺基酸包括(但不限於)羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽、O-磷酸絲胺酸、鈴蘭胺酸(azetidinecarboxylic acid)、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、第三丁基甘胺酸、2,4-二胺基異丁酸、鎖鏈素(desmosine)、2,2'-二胺基庚二酸、2,3-二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-甲基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺酸、高脯胺酸、羥離胺酸、別羥離胺酸、3-羥脯胺酸、4-羥脯胺酸、鎖鏈素、別異白胺酸、N-甲基丙胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基戊基甘胺酸、N-甲基纈胺酸、萘基丙胺酸、正纈胺酸、正白胺酸、鳥胺酸、戊基甘胺酸、六氫菸鹼酸(pipecolic acid)及硫代脯胺酸。術語「胺基酸」亦包括納入蛋白質中之為某些有機體內之代謝物，但不由遺傳密碼編碼之天然胺基酸。此等胺基酸包括(但不限於)鳥胺酸、D-鳥胺酸及D-精胺酸。
    本文所用術語「胺基酸類似物」係指具有與天然胺基酸相同之基本化學結構(僅舉例而言，結合氫、羧基、胺基及R基團之α-碳)之化合物。胺基酸類似物包括可逆或不可逆地經化學嵌段或C-端羧基、N-端胺基及/或側鏈官能團經化學修飾之天然及非天然胺基酸。此等類似物包括(但不限於)甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸碸、S-(羧基甲基)-半胱胺酸、S-(羧基甲基)-半胱胺酸亞碸、S-(羧基甲基)-半胱胺酸碸、天冬胺酸-(β-甲基酯)、N-乙基甘胺酸、丙胺酸甲醯胺、高絲氨酸、正白氨酸及甲硫胺酸甲基鋶。
    本文所用術語「胺基酸模擬物」係指具有與胺基酸之一般化學結構不同，但以與天然胺基酸相似之方式發揮作用之結構的化學化合物。
    術語「生物活性FGF21變體」係指無論已引入FGF21多肽變體中之修飾之類型或數目而具有野生型FGF21多肽活性之本文所述任一FGF21多肽變體，該活性係(例如)降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇之能力：減小體重之能力；及改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性之能力。但FGF21活性程度相對於野生型FGF21多肽稍微降低之FGF21多肽變體可視為生物活性FGF21多肽變體。
    術語「有效量」及「治療有效量」各自係指FGF21蛋白質變體用於支持野生型FGF21多肽之可觀察程度之一或多種生物學活性之量，該等活性係(例如)降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇含量之能力；降低肝甘油三酯或脂質含量之能力；減小體重之能力；或改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性之能力。舉例而言，投與展現、罹患或傾向於罹患FGF21相關病症(例如1型或2型糖尿病、肥胖症或代謝症候群)之患者之「治療有效量」係誘導、改善或以其他方式改良與上述病症有關之病理症狀、疾病進展、生理狀況之改良或免於因上述病症而病死的量。出於本發明目的，「個體」或「患者」較佳為人類，但亦可為動物，更特定而言，為伴侶動物(例如，狗、貓及諸如此類)、農場動物(例如，牛、綿羊、豬、馬及諸如此類)及實驗室動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠及諸如此類)。
    本文所用術語「醫藥上可接受之載劑」或「生理上可接受之載劑」係指一或多種適於達成或增強FGF21蛋白質變體遞送之調配材料。
    術語「抗原」係指能夠被抗體結合且另外能夠在動物中用於產生能夠結合該抗原之表位之抗體的分子或分子之一部分。抗原可具有一或多個表位。
    術語「天然Fc」係指包含自消化全抗體獲得或藉由其他手段產生之非抗原結合片段之序列的分子或序列，無論其呈單體或多聚體形式，且可含有鉸鏈區域。天然Fc之原始免疫球蛋白源較佳為人類起源且可為任一免疫球蛋白，但IgG1及IgG2較佳。天然Fc分子由可藉由共價(即，二硫鍵)及非共價締合連接成二聚體或多聚體形式之單體多肽構成。天然Fc分子之單體亞單位間之分子間二硫鍵的數目介於1至4之間，此端視種類(例如，IgG、IgA及IgE)或亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1及IgGA2)而定。天然Fc之一個實例係自木瓜蛋白酶消化IgG獲得之經二硫鍵鍵結之二聚體(參見Ellison等人，1982,Nucleic Acids Res. 10: 4071-9)。本文所用術語「天然Fc」屬於單體、二聚體及多聚體形式。術語「Fc變體」係指自天然Fc修飾但仍包含補救受體、即FcRn(新生Fc受體)之結合位點之分子或序列。國際公開案第WO 97/34631號及第WO 96/32478號闡述實例性Fc變體以及與補救受體之相互作用，且其以引用方式併入本文中。因此，術語「Fc變體」可包含自非人類天然Fc人類化之分子或序列。此外，天然Fc包含可去除之區域，此乃因該等區域提供本發明FGF21突變體之融合分子不需要之結構特徵或生物學活性。因此，術語「Fc變體」包含缺乏一或多個天然Fc位點或殘基或其中一或多個Fc位點或殘基已經修飾之分子或序列，該等殘基影響或參與：(1)二硫鍵形成，(2)與所選宿主細胞之不相容性，(3)在所選宿主細胞中表現後之N-端異質性，(4)糖基化，(5)與補體之相互作用，(6)結合除補救受體以外之Fc受體，或(7)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。Fc變體進一步詳細地闡述於下文中。
    術語「Fc結構域」涵蓋天然Fc及Fc變體及如本文所定義之序列。與Fc變體及天然Fc分子一樣，術語「Fc結構域」包括呈單體或多聚體形式之分子，而無論自全抗體消化或藉由其他手段產生。在本發明之一些實施例中，Fc結構域可經由(例如)Fc結構域與FGF21序列之間之共價鍵融合至FGF21或FGF21突變體(包括FGF21或FGF21突變體之截短形式)。此等融合蛋白質可經由Fc結構域之締合形成多聚體且該等融合蛋白質與其多聚體二者皆為本發明之態樣。
    術語「聚乙二醇」或「PEG」係指聚伸烷基二醇化合物或其衍生物，其中使用或不使用偶合劑或使用偶合或活化部分進行衍化。
    術語「FGF21相關病症」及本文所類似使用之術語包括(但不限於)肥胖症、1型及2型糖尿病、胰腺炎、異常血脂症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症候群、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎臟疾病、糖尿病併發症、神經病變、胃輕癱及其他代謝障礙。
    「2型糖尿病」係特徵在於儘管可利用胰島素但仍產生過量葡萄糖之病況，且循環葡萄糖含量因葡萄糖清除不足而保持過高。
    「1型糖尿病」係特徵在於因總體缺乏胰島素所致之高血糖含量之病況。此發生於機體免疫系統攻擊胰腺中之產生胰島素之β細胞且對其造成損害時。隨後胰腺幾乎不產生胰島素。
    「胰腺炎」係胰腺發炎。
    「異常血脂症」係脂蛋白代謝病症，包括脂蛋白過度產生或不足。異常血脂症可表現為血液中之總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)膽固醇及甘油三酯濃度升高及高密度脂蛋白(HDL)膽固醇濃度降低。
    「非酒精性脂肪性肝炎(NASH)」係與酒精攝取無關、特徵在於肝細胞之脂肪改變、伴隨小葉內發炎及纖維化之肝疾病。
    「葡萄糖耐受不良」或葡萄糖耐受異常(IGT))係與心血管病狀風險增加相關之血糖異常的前期糖尿病狀態。前期糖尿病狀況阻止個體將葡萄糖有效地移入細胞中並利用其作為有效燃料源，從而導致血液中之葡萄糖含量升高及一定程度之胰島素抗性。
    「高血糖症」定義為血液中之過量糖(葡萄糖)。
    「低血糖症」(亦稱為低血糖)發生於血糖含量下降過低而不能向機體活動提供足夠能量時。
    「高胰島素血症」定義為血液中高於正常含量之胰島素。
    「胰島素抗性」定義為正常量之胰島素產生低於正常之生物反應之狀態。
    就人類個體而言，「肥胖症」可定義為該體重高於給定群體之理想體重20%(R. H. Williams,Textbook of Endocrinology，1974年，第904-916頁)。
    「代謝症候群」可定義為以下體徵中至少三者之群：腹部脂肪--多數男性，40英吋腰圍或更大；高血糖--空腹後至少110毫克/分升(mg/dl)；高甘油三酯--血流中至少150 mg/dL；低HDL--小於40 mg/dl；及血壓130/85 mmHg或更高。
    「高血壓(Hypertension或high blood pressure)」係全身動脈血壓暫時性或持續性升高至可能誘導心血管損傷或其他不良結果之程度。高血壓任意地定義為收縮血壓高於140 mmHg或舒張血壓高於90 mmHg。
    「心血管疾病」係與心臟或血管有關之疾病。
    「周邊動脈疾病」發生於血小板在將血液運載至頭、器官及四肢之動脈中堆積時。血小板可隨時間而使動脈硬化且變窄，從而限制富氧血液流入器官及機體其他部分。
    「動脈粥樣硬化」係血管疾病，其特徵在於大尺寸及中尺寸動脈之內膜中不規則分佈之脂質沈積物，從而造成動脈腔變窄且最終進行至纖維化及鈣化。病變通常為病灶性的且緩慢且間歇性地進展。血流受限導致多數臨床表現，其隨病變之分佈及嚴重程度而改變。
    「中風」係持續24小時以上與腦循環障礙有關之任何急性臨床事件。中風涉及不可逆腦損傷，其症狀之類型及嚴重程度取決於循環受損腦組織之位置及程度。
    「心臟衰竭」(亦稱為充血性心臟衰竭)係心臟不再能將足量血液抽送至機體其餘部分之病況。
    「冠心病」(亦稱為冠狀動脈疾病)係將血液及氧供應至心臟之小血管變窄。
    「腎臟疾病」或腎變係腎臟之任何疾病。糖尿病腎變係1型或2型糖尿病患者之主要發病及死亡原因。
    「糖尿病併發症」係由高血糖含量引起之諸如以下等其他機體功能之問題：腎臟、神經(神經病變)、足(足潰瘍及差循環)及眼(例如視網膜病變)。糖尿病亦增加心臟疾病及骨及關節病症之風險。糖尿病之其他長期併發症包括皮膚問題、消化問題、性功能障礙及牙齒及牙齦問題。
    「神經病變」係涉及腦神經或周邊或自主神經系統之任何疾病。
    「胃輕癱」係導致腸排空延遲之胃蠕動衰弱。
    本發明涵蓋之重症病患者通常經歷不穩定之代謝過盛狀態。此不穩定代謝狀態歸因於可導致一些營養物相對不足之基質代謝變化。通常，脂肪與肌肉二者之氧化會有所增加。
    此外，重症病患者較佳為經歷全身性發炎反應症候群或呼吸窘迫之患者。發病率之降低意指降低重症病患者發生其他疾病、病況或症狀之可能性或降低其他疾病、病況或症狀之嚴重程度。舉例而言，降低發病率可對應於減小菌血症或敗血症或與多器官衰竭相關之併發症之發生率。
    除非內容有另外明確的規定，本文所用單數形式「一(a、an)」及「該」包括複數個所提及物。因此，舉例而言，當提及「一種抗體」時包括兩種或更多種此類抗體之混合物。
    如本文所用，術語「約」係指一值之+/- 20%、+/- 10%或+/- 5%。
    術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用，係指任何長度之胺基酸的聚合形式，其可包括經編碼及非編碼之胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍化之胺基酸、及具有經修飾之肽骨架之多肽。該術語包括融合蛋白，包括(但不限於)帶有一個異源胺基酸序列之融合蛋白，具有異源及同源前導序列、有或無N-端甲硫胺酸殘基之融合體；經免疫學標記之蛋白質；及諸如此類。
    術語「個體(individual或subject)」、「宿主」及「患者」可互換使用，係指任何期望接受診斷、治療或醫治者，尤其人。其他個體可包括牛、犬、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬及諸如此類。在一些較佳實施例中，個體係人類。
    本文所用術語「試樣」係指取自患者之生物學材料。本發明所分析之試樣不侷限於任何特定類型。試樣包括(作為非限制性實例)：單細胞、多細胞、組織、腫瘤、生物學液體、生物學分子、或上清液或上述任一種之提取物。實例包括用於活體組織檢查移除之組織、在切除手術期間移除的組織、血液、尿液、淋巴組織、淋巴液、腦脊液、黏液及糞便試樣。所用試樣將基於分析形式、檢測方法、及擬分析之腫瘤、組織、細胞或提取物之性質而變化。製備試樣之方法為業內所熟知且可輕易修改以獲得與所用方法相容之試樣。
    本文所用術語「生物學分子」包括(但不限於)：多肽、核酸及糖類。
    本文所用術語「調節(modulating)」係指細胞內部、外部、或表面上之基因、蛋白質、或任何分子之品質或數量的改變。該改變可為該分子之表現或量的增大或減小。術語「調節(modulate)」亦包括改變生物學功能/活性包括(但不限於)以下能力之品質或數量：降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇含量；降低肝脂質或肝甘油三酯含量；減小體重；及改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性。
    本文所用術語「調節劑」係指調節一或多種與FGF21相關病症(1型或2型糖尿病；或代謝病況，例如肥胖症)相關之生理學或生物化學事件的組合物。該等事件包括(但不限於)降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇含量之能力；降低肝脂質或肝甘油三酯含量之能力；減小體重之能力；及改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性之能力。
    「基因產物」係一種由基因表現或產生之生物聚合產物。基因產物可為(例如)非剪接之RNA、mRNA、剪接變體mRNA、多肽、轉譯後修飾之多肽、剪接變體多肽等。此術語亦涵蓋使用RNA基團產物作為模板製造之生物聚合產物(即，該RNA之cDNA)。基因產物可用酶法、重組法、化學法、或於天然包含該基因之細胞內製造。在一些實施例中，若該基因產物係蛋白質性質的，則其展現生物活性。在一些實施例中，若該基因產物係核酸，則其可轉譯成展現生物活性之蛋白質性質的基因產物。
    本文所用「FGF21活性之調節」係指FGF21活性之增大或減小，其可能為(例如)一種藥劑與一種FGF21多核苷酸或多肽之相互作用、FGF21轉錄及/或轉譯之抑制(例如經由反義或siRNA與FGF21基因或FGF21轉錄物相互作用、經由對促進FGF21表現之轉錄因子的調節)、及諸如此類之結果。舉例而言，生物學活性之調節係指生物學活性之增強或減弱。FGF21活性可藉助包括(但不限於)分析個體之血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇含量、評估FGF21多肽含量或藉由評估FGF21轉錄量進行評估。FGF21活性之比較亦可藉由(例如)量測FGF21下游生物標記物之含量及量測FGF21信號傳導之增加來實施。FGF21活性亦可藉由量測以下來評估：細胞信號傳導；激酶活性；至脂肪細胞中之葡萄糖攝取；血液胰島素、甘油三酯或膽固醇含量波動；肝脂質或肝甘油三酯含量改變；FGF21與FGF21受體間之相互作用；或FGF21受體之磷酸化。在一些實施例中，FGF21受體之磷酸化可為酪胺酸磷酸化。在一些實施例中，對FGF21活性之調節可引起對FGF21相關表型之調節。
    本文所用「FGF21下游生物標記物」係基因或基因產物或基因或基因產物之可量測標記。在一些實施例中，為FGF21下游標記物之基因或活性展現改變之表現程度，或位於血管組織中。在一些實施例中，在FGF21調節劑存在下改變下游標記物之活性。在一些實施例中，當FGF21受到本發明之FGF21調節劑干擾時，該等下游標記物展現表現程度改變。FGF21下游標記物包括(但不限於)葡萄糖或2-去氧-葡萄糖攝取、pERK及其他磷酸化或乙醯基化蛋白質或NAD含量。
    本文所用術語「調升(up-regulates)」係指活性或數量之增加、活化或刺激。舉例而言，關於本發明，FGF21調節劑可增加FGF21受體之活性。在一個實施例中，FGFR-1c或FGFR-4中之一或二者可對FGF21調節劑作出反應而調升。調升亦可係指FGF21-有關活性，例如，降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇含量之能力；降低肝脂質或甘油三酯含量之能力；減小體重之能力；改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性之能力；或引起FGF21受體磷酸化之能力；或增加FGF21下游標記物之能力。FGFR21受體可為FGFR-1c或FGFR-4中之一或二者。與對照相比，調升可為至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少400%或至少500%。
    本文所用術語「N-端」係指蛋白質之至少最初10個胺基酸。
    本文所用術語「N-端結構域」及「N-端區域」可互換使用且係指始於蛋白質之第一個胺基酸且止於蛋白質之N-端半之任一胺基酸的蛋白質片段。舉例而言，FGF21之N-端結構域係自SEQ ID NO:1之第1個胺基酸至SEQ ID NO:1之約第10胺基酸與第105個胺基酸間之任一胺基酸。
    本文所用術語「C-端」係指蛋白質之至少最後10個胺基酸。
    本文所用術語「C-端結構域」及「C-端區域」可互換使用且係指始於蛋白質之C-端半之任一胺基酸且止於蛋白質之最後一個胺基酸的蛋白質片段。舉例而言，FGF21之C-端結構域始於SEQ ID NO:1之第105個胺基酸至約第200個胺基酸中之任一胺基酸且止於SEQ ID NO:1之第209個胺基酸。
    本文所用術語「結構域」指一個生物分子上貢獻於該生物分子已知或疑似功能之結構部分。結構域可與其區域或部分共同延伸，且亦可結合一個生物分子之一個不同於特定區域之部分，除結合該特定區域的之全部或一部分外。
    本文所用術語「信號結構域」(亦稱為「信號序列」或「信號肽」)係指位於前體蛋白質(通常為膜結合或分泌蛋白質)之N-端區域處之連續胺基酸序列延伸段中且參與轉譯後蛋白質運送的肽結構域。在許多情形下，在已完成分選過程後藉由特化信號肽酶自全長蛋白質去除信號結構域。每一信號結構域為前體蛋白質指定細胞中之具體終點。FGF21之信號結構域係SEQ ID NO:1之胺基酸1-28。
    本文所用術語「受體結合結構域」係指蛋白質中接觸膜結合受體蛋白質從而產生細胞反應(例如信號傳導事件)之任一部分或區域。
    本文所用術語「配體結合域」係指一個保留FGF21對應天然序列之至少一種定性結合活性之蛋白質的任一部分或區域。
    術語「區域」係指生物分子之一級結構之物理鄰接部分。當為蛋白質時，區域係定義為該蛋白質之胺基酸序列的一個鄰接部分。在一些實施例中，「區域」與該生物分子之功能相關。
    本文所用術語「片段」係指生物分子之一級結構之物理鄰接部分。當為蛋白質時，一部分係定義為該蛋白質之胺基酸序列的一個鄰接部分，且係指至少3-5個胺基酸、至少8-10個胺基酸、至少11-15個胺基酸、至少17-24個胺基酸、至少25-30個胺基酸及至少30-45個胺基酸。當為寡核苷酸時，一部分係定義為該寡核苷酸之核酸序列的一個鄰接部分，且係指至少9-15個核苷酸、至少18-30個核苷酸、至少33-45個核苷酸、至少48-72個核苷酸、至少75-90個核苷酸、及至少90-130個核苷酸。在一些實施例中，生物分子之部分具有生物活性。關於本發明，FGF21多肽片段不包含SEQ ID NO:1中所示之整個FGF21多肽序列。
    「天然序列」多肽係具有與得自自然界之多肽相同之胺基酸序列者。此等天然序列多肽可自自然界分離或可藉由重組或合成手段產生。因此，天然序列多肽可具有天然人類多肽、鼠類多肽或來自任一其他哺乳動物物種之多肽之胺基酸序列。
    本文所用片語「同源核苷酸序列」或「同源胺基酸序列」或其變體係指在核苷酸層面或胺基酸層面以至少一個特定百分比之同源性表徵的序列，與「序列一致性」可互換使用。同源核苷酸序列包括編碼蛋白質異構形式之序列。因為例如RNA之選擇性剪接，此等異構形式可在同一有機體之不同組織中表現。或者，異構形式可由不同基因編碼。同源核苷酸序列包括編碼人類以外物種(包括但不限於哺乳動物)之蛋白質的核苷酸序列。同源核苷酸序列亦包括(但不限於)天然產生的對偶基因變體及本文所示核苷酸序列之突變體。同源胺基酸序列包括含有保守的胺基酸取代基且多肽具有相同結合性及/或活性之胺基酸序列。在一些實施例中，若核苷酸或胺基酸序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，則其係同源的。在一些實施例中，若核苷酸或胺基酸序列具有1-10、10-20、20-30、30-40、40-50或50-60個核苷酸/胺基酸取代、添加或缺失，則其係同源的。在一些實施例中，同源胺基酸序列具有不超過5個或不超過3個保守胺基酸取代。
    同源性或一致性百分比可藉由(例如)Gap程式(Wisconsin Sequence Analysis Package，第8版，用於UNIX，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison WI)使用預設設定(default setting)(其使用Smith及Waterman(Adv. Appl. Math.,1981,2,482-489)的算法)進行測定。在一些實施例中，探針與靶標間之同源性介於約75%至約85%之間。在一些實施例中，核酸具有核苷酸與SEQ ID NO:2或其一部分至少約95%、約97%、約98%、約99%及約100%同源。
    同源性亦可在多肽層面。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:1、或其一部分約95%、約97%、約98%、約99%及約100%同源。本發明FGF21變體(「本發明序列」，例如變體1或SEQ ID NO:5)與不同胺基酸序列(「外來序列」，例如L174變為P174之SEQ ID NO:1)之一致性程度或百分比計算為兩個序列之比對中之準確匹配數目除以「本發明序列」或「外來序列」之長度，而無論哪個序列最短。結果表示為一致性百分比。舉例而言，變體1(SEQ ID NO:5)與L174變為P174之野生型FGF21(L174變為P174之SEQ ID NO:1)具有94.9%一致性。對於該兩個序列而言，存在168個一致胺基酸且總長度係177個胺基酸。因此，一致性百分比係(168/177) x 100=94.9%。
    本文所用術語「混合」係指將一或多種化合物、細胞、分子及諸如此類一起合併在一個相同區域的方法。此可在(例如)試管，陪替氏(petri)培養皿，或任何可混合一或多種化合物、細胞、或分子之容器中進行。
    本文所用術語「實質上純化」係指一種化合物(例如多核苷酸或多肽或抗體)自其天然環境移出且已去除其天然結合的其他組份之至少60%、至少75%及至少90%。
    術語「醫藥上可接受之載劑」係指一種用於投與治療劑(例如抗體或多肽、基因及其他治療劑)之載劑。該術語係指其自身不會誘導產生對於接受該組合物之個體有害之抗體的任何藥物載劑，且其投與應無不當毒性。適宜載劑可為大的、緩慢代謝之大分子，例如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物、脂質聚集物及無活性的病毒顆粒。此等載劑為熟習此項技術者所熟知。治療組合物中醫藥上可接受之載劑可包括液體，例如水、鹽水、甘油及乙醇。輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑，pH緩衝物質及諸如此類，亦可存在於此類媒劑中。
    如藉由半胱胺酸殘基提供之天然二硫鍵通常增加蛋白質之熱力學穩定性。如以熔點增加所量測增加之熱力學穩定性的成功實例係T4溶菌酶(Matsumura等人，PNAS 86:6562-6566(1989))及芽孢桿菌RNA酶(barnase)(Johnson等人，J. Mol. Biol. 268:198-208(1997))之多個二硫鍵結之突變體。本發明之一態樣係在防腐劑存在下增強FGF21之物理穩定性，此穩定性係藉由在變體內存在之二硫鍵來達成，該等二硫鍵束縛野生型FGF21之撓性且藉此限制防腐劑進入蛋白質之疏水核。
    因此本發明之第二態樣提供人類FGF21之變體或其生物活性肽，其具有藉由納入額外二硫鍵(例如，經由將半胱胺酸殘基納入或取代至野生型FGF21蛋白質或本發明之多肽及蛋白質變體中)所增強之醫藥穩定性。熟習此項技術者應認識到，除本文所述所建議之實施例外，天然半胱胺酸、半胱胺酸103及半胱胺酸121亦可用作基因座以引入可賦予改良性質之新穎二硫鍵。
    其包括用半胱胺酸取代以下中之兩者或更多者之FGF-21：麩醯胺酸46、精胺酸47、酪胺酸48、白胺酸49、酪胺酸50、蘇胺酸51、天冬胺酸鹽52、天冬胺酸鹽53、丙胺酸54、麩醯胺酸55、麩醯胺酸56、蘇胺酸57、麩胺酸鹽58、丙胺酸59、組胺酸60、白胺酸61、麩胺酸鹽62、異白胺酸63、纈胺酸69、甘胺酸70、甘胺酸71、丙胺酸72、丙胺酸73、白胺酸144、組胺酸145、白胺酸146、脯胺酸147、甘胺酸148、天冬醯胺酸149、離胺酸150、絲胺酸151、脯胺酸152、組胺酸153、精胺酸154、天冬胺酸鹽155、脯胺酸156、丙胺酸157、脯胺酸158、精胺酸159、甘胺酸160、脯胺酸161、丙胺酸162、精胺酸163、苯丙胺酸164，其中該等胺基酸之編號係基於全長209個胺基酸之hFGF21序列SEQ ID NO:1。
    此外，所提供人類FGF21之變體或其生物活性肽除Cys103-Cys121處之天然二硫鍵外亦具有如下經改造二硫鍵：Gln46Cys-Ala59Cys、Gln46Cys-His60Cys、Gln46Cys-Leu61Cys、Gln46Cys-Glu62Cys、Gln46Cys-Ile63Cys、Arg47Cys-Ala59Cys、Arg47Cys-His60Cys、Arg47Cys-Leu61Cys、Arg47Cys-Glu62Cys、Arg47Cys-Ile63Cys、Tyr48Cys-Ala59Cys、Tyr48Cys-His60Cys、Tyr48Cys-Leu61Cys、Tyr48Cys-Glu62Cys、Tyr48Cys-Ile63Cys、Leu49Cys-Ala59Cys、Leu49Cys-His60Cys、Leu49Cys-Leu61Cys、Leu49Cys-Glu62Cys、Leu49Cys-Ile63Cys、Tyr50Cys-Ala59Cys、Tyr50Cys-His60Cys、Tyr50Cys-Lue61Cys、Tyr50Cys-Glu62Cys、Tyr50Cys-Ile63Cys、Leu144Cys-Gly160Cys、Leu144Cys-Pro161Cys、Leu144Cys-Ala162Cys、Leu144Cys-Arg163Cys、Leu144Cys-Phe164Cys、His145Cys-Gly160Cys、His145Cys-Pro161Cys、His145Cys-Ala162Cys、His145Cys-Arg163Cys、His145Cys-Phe164Cys、Leu146Cys-Gly160Cys、Leu146Cys-Pro161Cys、Leu146Cys-Ala162Cys、Leu146Cys-Arg163Cys、Leu146Cys-Phe164Cys、Pro147Cys-Gly160Cys、Pro147Cys-Pro161Cys、Pro147Cys-Ala162Cys、Pro147Cys-Arg163Cys、Pro147Cys-Phe164Cys、Gly148Cys-Gly160Cys、Gly148Cys-Pro161Cys、Gly148Cys-Ala162Cys、Gly148Cys-Arg163Cys、Gly148Cys-Phe164Cys、Thr57Cys-Val69Cys、Thr57Cys-Gly70Cys、Thr57Cys-Gly71Cys、Thr57Cys-Ala72Cys、Thr57Cys-Ala73Cys、Glu58Cys-Val69Cys、Glu58Cys-Glu70Cys、Glu58Cys-G71Cys、Glu58Cys-Ala72Cys、Glu58Cys-Ala73Cys、Ala59Cys-Val69Cys、Ala59Cys-Gly70Cys、Ala59Cys-Gly71Cys、Ala59Cys-Ala72Cys、Ala59Cys-Ala73Cys、His60Cys-Val69Cys、His60Cys-Gly70Cys、His60Cys-Gly71Cys、His60Cys-Ala72Cys、His60Cys-Ala73Cys、Leu61Cys-Val69Cys、Leu61Cys-Gly70Cys、Leu61Cys-Gly71Cys、Leu61Cys-Ala72Cys、Leu61Cys-Ala73Cys、Arg47Cys-Gly148Cys、Tyr48Cys-Gly148Cys、Leu49Cys-Gly148Cys、Tyr50Cys-Gly148Cys、Thr51Cys-Gly148Cys、Asp52Cys-Gly148Cys、Asp53Cys-Gly148Cys、Ala54Cys-Gly148Cys、Gln55Cys-Gly148Cys、Gln56Cys-Gly148Cys、Thr57Cys-Gly148Cys、Glu58Cys-Gly148Cys、Arg47Cys-Asn149Cys、Tyr48Cys-Asn149Cys、Leu49Cys-Asn149Cys、Tyr50Cys-Asn149Cys、Thr51Cys-Asn149Cys、Asp52Cys-Asn149Cys、Asp53Cys-Asn149Cys、Ala54Cys-Asn149Cys、Gln55Cys-Asn149Cys、Gln56Cys-Asn149Cys、Thr57Cys-Asn149Cys、Glu58Cys-Asn149Cys、Arg47Cys-Lys150Cys、Tyr48Cys-Lys150Cys、Leu49Cys-Lys150Cys、Tyr50Cys-Lys150Cys、Thr51Cys-Lys150Cys、Asp52Cys-Lys150Cys、Asp53Cys-Lys150Cys、Ala54Cys-Lys150Cys、Gln55Cys-Lys150Cys、Gln56Cys-Lys150Cys、Thr57Cys-Lys150Cys、Glu58Cys-Lys150Cys、Arg47Cys-Ser151Cys、Tyr48Cys-Ser151Cys、Leu49Cys-Ser151Cys、Tyr50Cys-Ser151Cys、Thr51Cys-Ser151Cys、Asp52Cys-Ser151Cys、Asp53Cys-Ser151Cys、Ala54Cys-Ser151Cys、Gln55Cys-Ser151Cys、Gln56Cys-Ser151Cys、Thr57Cys-Ser151Cys、Glu58Cys-Ser151Cys、Arg47Cys-Pro152Cys、Tyr48Cys-Pro152Cys、Leu49Cys-Pro152Cys、Tyr50Cys-Pro152Cys、Thr51Cys-Pro152Cys、Asp52Cys-Pro152Cys、Asp53Cys-Pro152Cys、A1a54Cys-Pro152Cys、Gln55Cys-Pro152Cys、Gln56Cys-Pro152Cys、Thr57Cys-Pro152Cys、Glu58Cys-Pro152Cys、Arg47Cys-His153Cys、Tyr48Cys-His153Cys、Leu49Cys-His153Cys、Tyr50Cys-His153Cys、Thr51Cys-His153Cys、Asp52Cys-His153Cys、Asp53Cys-His153Cys、Ala54Cys-His153Cys、Gln55Cys-His153Cys、Gln56Cys-His153Cys、Thr57Cys-His153Cys、Glu58Cys-His153Cys、Arg47Cys-Arg154Cys、Tyr48Cys-Arg154Cys、Leu49Cys-Arg154Cys、Tyr50Cys-Arg154Cys、Thr51Cys-Arg154Cys、Asp52Cys-Arg154Cys、Asp53Cys-Arg154Cys、Ala54Cys-Arg154Cys、Gln55Cys-Arg154Cys、Gln56Cys-Arg154Cys、Thr57Cys-Arg154Cys、Glu58Cys-Arg154Cys、Arg47Cys-Asp155Cys、Tyr48Cys-Asp155Cys、Leu49Cys-Asp155Cys、Tyr50Cys-Asp155Cys、Thr51Cys-Asp155Cys、Asp52Cys-Asp155Cys、Asp53Cys-Asp155Cys、Ala54Cys-Asp155Cys、Gln55Cys-Asp155Cys、Gln56Cys-Asp155Cys、Thr57Cys-Asp155Cys、Glu58Cys-Asp155Cys、Arg47Cys-Pro156Cys、Tyr48Cys-Pro156Cys、Leu49Cys-Pro156Cys、Tyr50Cys-Pro156Cys、Thr51Cys-Pro156Cys、Asp52Cys-Pro156Cys、Asp53Cys-Pro156Cys、Ala54Cys-Pro156Cys、Gln55Cys-Pro156Cys、Gln56Cys-Pro156Cys、Thr57Cys-Pro156Cys、Glu58Cys-Pro156Cys、Arg47Cys-Ala157Cys、Tyr48Cys-Ala157Cys、Leu49Cys-Ala157Cys、Tyr50Cys-Ala157Cys、Thr51Cys-Ala157Cys、Asp52Cys-Ala157Cys、Asp53Cys-Ala157Cys、Ala54Cys-Ala157Cys、Gln55Cys-Ala157Cys、Gln56Cys-Ala157Cys、Thr57Cys-Ala157Cys、Glu58Cys-Ala157Cys、Arg47Cys-Pro158Cys、Tyr48Cys-Pro158Cys、Leu49Cys-Pro158Cys、Tyr50Cys-Pro158Cys、Thr51Cys-Pro158Cys、Asp52Cys-Pro158Cys、Asp53Cys-Pro158Cys、Ala54Cys-Pro158Cys、Gln55Cys-Pro158Cys、Gln56Cys-Pro158Cys、Thr57Cys-Pro158Cys、Glu58Cys-Pro158Cys、Arg47Cys-Arg159Cys、Tyr48Cys-Arg159Cys、Leu49Cys-Arg159Cys、Tyr50Cys-Arg159Cys、Thr51Cys-Arg159Cys、Asp52Cys-Arg159Cys、Asp53Cys-Arg159Cys、Ala54Cys-Arg159Cys、Gln55Cys-Arg159Cys、Gln56Cys-Arg159Cys、Thr57Cys-Arg159Cys、Glu58Cys-Arg159Cys、Arg47Cys-G160Cys、Tyr48Cys-G160Cys、Leu49Cys-G160Cys、Tyr50Cys-Gly160Cys、Thr51Cys-Gly160Cys、Asp52Cys-Gly160Cys、Asp53Cys-Gly160Cys、Ala54Cys-Gly160Cys、Gln55Cys-Gly160Cys、Gln56Cys-Gly160Cys、Thr57Cys-Gly160Cys、Glu58Cys-Gly160Cys、Arg47Cys-Pro161Cys、Tyr48Cys-Pro161Cys、Leu49Cys-Pro161Cys、Tyr50Cys-Pro161Cys、Thr51Cys-Pro161Cys、Asp52Cys-Pro161Cys、Asp53Cys-Pro161Cys、Ala54Cys-Pro161Cys、Gln55Cys-Pro161Cys、Gln56Cys-Pro161Cys、Thr57Cys-Pro161Cys、Glu58Cys-Pro161Cys、Arg47Cys-Ala162Cys、Tyr48Cys-Ala162Cys、Leu49Cys-Ala162Cys、Tyr50Cys-Ala162Cys、Thr51Cys-Ala162Cys、Asp52Cys-Ala162Cys、Asp53Cys-Ala162Cys、Ala54Cys-Ala162Cys、Gln55Cys-Alal62Cys、Gln56Cys-Ala162Cys、Thr57Cys-Ala162Cys、G1u58Cys-Ala162Cys、Arg47Cys-Arg163Cys、Tyr48Cys-Arg163Cys、Leu49Cys-Arg163Cys、Tyr50Cys-Arg163Cys、Thr51Cys-Arg163Cys、Asp52Cys-Arg163Cys、Asp53Cys-Arg163Cys、Ala54Cys-Arg163Cys、Gln55Cys-Arg163Cys、Gln56Cys-Arg163Cys、Thr57Cys-Arg163Cys、Glu58Cys-Arg163Cys。
    本發明之第三態樣提供人類FGF21之變體或其生物活性肽，其包含任一帶電及/或極性但不帶電胺基酸於本發明之第一實施例中所示任一胺基酸位置處之取代與半胱胺酸於本發明之第二實施例中所示兩個或更多個胺基酸位置處之取代的組合。
    業內已熟知，研究蛋白質醫藥中之巨大挑戰係應對蛋白質之物理及化學不穩定性。此在期望蛋白質醫藥調配物為多種用途、可注射調配物時甚至更為明顯，該調配物需要穩定、經濃縮且防腐處理之溶液，同時維持有利的生物活性輪廓。對野生型FGF21之詳細生物物理表徵確定，濃縮蛋白質溶液(>5 mg/ml)在暴露於應力條件(例如高溫或低pH)下時會導致加速締合及聚集(即，差物理穩定性及生物醫藥性質)。FGF21之濃縮蛋白質溶液暴露於醫藥防腐劑(例如，間甲酚)亦對物理穩定性具有負面影響。
    因此，本發明之一實施例係在生理及經防腐處理之調配物條件下增強濃縮溶液之物理穩定性，同時維持化學穩定性及生物學效能。吾人認為締合及聚集可能源自疏水相互作用，此乃因在給定蛋白質濃度下，溫度及離子強度對物理穩定性具有顯著影響。在極大程度上，靶向非保守假定表面暴露之胺基酸殘基。分析該等殘基之局部環境且選擇認為在結構上不重要之殘基進行誘變。一種起始特定改變之方法係藉由引入麩胺酸殘基(「麩胺酸掃描」)進一步減小蛋白質之pI。人們猜測，引入帶電取代基可因電荷-電荷排斥而抑制疏水調介之聚集，且可能改良防腐劑相容性。另外，熟習此項技術者亦會認識到，在足夠的誘變程度下，可藉由引入正電荷，同時減少或不減少負電荷，由此容許產生電荷-電荷排斥來使pI移至鹼性pH範圍內。
    儘管本發明實施例係關於在生理醫藥調配物條件與經防腐處理之條件二者下之物理及化學穩定性，但維持與野生型FGF21相比變體之生物學效能亦係重要考慮因素。因此，本發明變體之生物學效能定義為變體影響葡萄糖攝取(如在活體外3T3-L1脂肪細胞2-DOG攝取細胞分析(實例3)中所量測)之能力及/或血漿葡萄糖含量以及血漿甘油三酯(如在ob/ob小鼠分析(實例5)中所實施活體內量測)之降低。
    根據本發明投與之FGF21之變體可藉由業內已知之任何手段產生及/或分離。產生該變體之最佳方法係經由重組DNA方法且為熟習此項技術者所熟知。此等方法闡述於Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons公司)中，其以引用方式併入本文中。
    另外，較佳實施例包括源自本文所述變體之生物活性肽。此一肽將含有所述取代中之至少一者且該變體將具有生物學活性。該肽可藉由熟習此項技術者已知之任何及所有手段產生，該等手段之實例包括(但不限於)酶促消化、化學合成或重組DNA方法。
    業內已確定，某些成纖維細胞生長因子之肽片段具有生物活性。例如，參見Baird等人，Proc. Natl. Acad. Sci(USA) 85:2324-2328(1988)及J. Cell. Phys. Suppl. 5:101-106(1987)。因此，對變體之片段或肽之選擇係基於業內已知之標準，舉例而言，已知二肽基肽酶IV(DPP-IV)係參與神經肽、內分泌肽及細胞激素失活之絲胺酸型蛋白酶(Damme等人Chem. Immunol. 72: 42-56,(1999))。FGF21之N-端(HisProIlePro)含有兩個可潛在地為DPP-IV之受質之二肽，從而產生FGF21於N-端藉由4個胺基酸截短之片段。意想不到的是，已證實，野生型FGF21之此片段保持生物學活性(表2)，因此，N-端藉由最多4個胺基酸截短之本發明變體係本發明之一實施例。
    本發明亦涵蓋編碼上述變體之多核苷酸，其可呈RNA形式或呈DNA形式，該DNA包括cDNA、基因組DNA及合成DNA。DNA可為雙鏈或單鏈。編碼本發明變體之編碼序列可因遺傳密碼之冗餘及簡併而變化。
    編碼本發明變體之多核苷酸可包括以下：僅變體之編碼序列，變體之編碼序列及額外編碼序列(例如功能多肽)，或前導序列或分泌序列或前蛋白質序列；變體之編碼序列及非編碼序列，例如變體編碼序列之內含子或5'及/或3'非編碼序列。因此，術語「編碼變體之多核苷酸」涵蓋多核苷酸，其可不僅包括變體之編碼序列且亦包括包括額外編碼及/或非編碼序列之多核苷酸。
    本發明進一步係關於編碼多肽之含有所示取代之片段、類似物及衍生物的所述多核苷酸之變體。多核苷酸之變體可為人類FGF21序列之天然對偶基因變體、非天然變體或截短變體，如上文所述。因此，本發明亦包括編碼上述變體之多核苷酸以及此等多核苷酸之變體，該等多核苷酸變體編碼所揭示變體之片段、衍生物或類似物。此等核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、截短變體及添加或插入變體，只要存在第一或第二實施例之所示胺基酸取代之至少一者即可。
    本發明之多核苷酸將在序列已可操作地連接至表現控制序列(即，經定位以確保其功能)後在宿主中表現。該等表現載體通常可在宿主有機體中以離合染色小體(episome)形式或以宿主染色體DNA之組成部分形式複製。通常，表現載體將含有選擇標記物，例如，四環素(tetracycline)、新黴素(neomycin)及二氫葉酸還原酶，以允許檢測該等用期望DNA序列轉形之細胞。FGF21變體可在哺乳動物細胞、昆蟲、酵母、細菌或其他細胞中在適當啟動子控制下表現。亦可採用無細胞轉譯系統使用源自本發明DNA構築體之RNA產生此等蛋白質。
    大腸桿菌係尤其可用於選殖本發明多核苷酸之原核宿主。其他適用微生物宿主包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)、鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)以及鋸桿菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)及葡萄球菌屬(Staphylococcus)之不同種，但亦可採用其他作為選擇物。在該等原核宿主中，亦可製備通常將含有可與宿主細胞相容之表現控制序列(例如，複製起點)的表現載體。另外，可存在許多習知啟動子中之任一者，例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自λ或T7噬菌體之啟動子系統。啟動子通常將視情況與操縱子序列一起控制表現，且具有核糖體結合位點序列及諸如此類，以用於起始及完成轉錄及轉譯。
    熟習蛋白質表現之技術者應認識到，甲硫胺酸或甲硫胺酸-精胺酸序列可在成熟序列(SEQ ID NO: 3)之N-端引入以供在大腸桿菌中表現且涵蓋於本發明上下文中。因此，除非另有說明，否則在大腸桿菌中表現之本發明變體具有在N-端引入之甲硫胺酸序列。
    其他微生物(例如酵母或真菌)亦可用於表現。畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)係較佳酵母宿主之實例，其中適宜載體視需要具有表現控制序列，例如啟動子(包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶)及複製起點、終止序列及諸如此類。黑麯黴(Aspergillus niger)、瑞氏木黴(Trichoderma reesei)及裂褶菌(Schizophyllum commune)係真菌宿主之實例，但亦可採用其他作為選擇物。
    亦可使用哺乳動物組織細胞培養物來表現及產生本發明多肽。真核細胞實際上較佳，此乃因業內已知研發出許多能夠分泌完整變體之適宜宿主細胞系，且包括CHO細胞系、各種COS細胞系、NSO細胞、敍利亞倉鼠卵巢細胞系(Syrian Hamster Ovary cell line)、HeLa細胞或人類胚腎細胞系(即，HEK293、HEK293EBNA)。
    用於該等細胞之表現載體可包括表現控制序列，例如複製起點、啟動子、增強子；及必需加工資訊位點，例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點及轉錄終止子序列。較佳表現控制序列係源自SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒、勞斯肉瘤病毒(Raus sarcoma virus)及諸如此類之啟動子。較佳多腺苷酸化位點包括源自SV40及牛生長激素之序列。
    可藉由習知方法將含有所關注多核苷酸序列(例如，FGF21之變體及表現控制序列)之載體轉移至宿主細胞中，該等方法視細胞宿主類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。
    可採用各種蛋白質純化方法且此等方法為業內已知且闡述於(例如)Deutscher,Methods in Enzymology 182: 83-9(1990)及Scopes,Protein Purification: Principles and Practice,Springer-Verlag,NY(1982)中。所選純化步驟將取決於(例如)用於FGF21之變體之產生方法的性質。
    含有FGF21變體之組合物應以與良好醫學實踐一致之方式調配及給予，且考慮患者之臨床狀況、FGF21變體組合物之遞送位點、投與方法、投與計劃及從業者已知之其他因素。因此，出於本文目的，藉由此等考慮因素來確定FGF21變體之「治療有效量」。
    FGF21變體及本發明之醫藥組合物可藉由達成一般預定目的之任何手段投與：治療1型及2型糖尿病、肥胖症、代謝症候群或重症病患者。本文所用術語「非經腸」係指投與模式，包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下及關節內注射及輸注。投與劑量將取決於接受者之年齡、健康狀況及重量、併行治療之種類(若有)、治療頻率及期望效應之性質。本發明範圍內之組合物包括所有組合物，其中FGF21變體係以有效達成治療1型或2型糖尿病、肥胖症或代謝症候群之期望醫學效應之量存在。儘管個體需要可依患者而不同，但確定所有組份之有效量的最佳範圍在熟習此項技術之臨床醫生之能力範圍內。
    本發明FGF21之變體可根據已知方法調配以製備醫藥有用組合物。期望調配物可為利用適當稀釋劑或高純度水溶液且利用醫藥上可接受之可選載劑、防腐劑、賦形劑或穩定劑重構成之穩定凍乾產品的調配物[Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)]。本發明變體可與醫藥上可接受之緩衝劑組合，且pH經調節以提供可接受之穩定性，且pH可接受用於投與。
    對於非經腸投與而言，在一個實施例中，FGF21變體通常可藉由將其一或多者以期望純度及單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液或乳液)與醫藥上可接受之載劑(即，在所用劑量及濃度下對接受者無毒且可與調配物之其他成份相容者)混合來調配。較佳地，可添加一或多種醫藥上可接受之抗微生物劑。苯酚、間甲酚及苯甲醇係較佳醫藥上可接受之抗微生物劑。
    視情況，可添加一或多種醫藥上可接受之鹽以調節離子強度或張力。可添加一或多種賦形劑以進一步調節調配物之等張性。甘油、氯化鈉及甘露醇係調節等張性之賦形劑之實例。
    熟習此項技術者可容易地優化包含FGF21變體之治療組合物之醫藥有效劑量及投與方案，如藉由良好醫學實踐及個別患者之臨床狀況所確定。對於成人而言，本發明FGF21變體之典型劑量範圍應在約0.01 mg/天至約1000 mg/天(或約0.05 mg/週至約5000 mg/週，每週投與一次)之範圍內。較佳地，劑量在約0.1 mg/天至約100 mg/天(或約0.5 mg/週至約500 mg/週，每週投與一次)、更佳約1.0 mg/天至約10 mg/天(或約5 mg/週至約50 mg/週，每週投與一次)之範圍內。最佳地，劑量係約1-5 mg/天(或約5 mg/週至約25 mg/週，每週投與一次)。所投與適當劑量之FGF21變體可藉由較快且較有效之葡萄糖利用降低血糖含量並增加能量消耗，且因此可用於治療1型及2型糖尿病、肥胖症及代謝症候群。
    另外，由於高血糖症及胰島素抗性在給予營養支持之重症病患者中較為常見，因此一些ICU投與胰島素以治療進食重症病患者之極度高血糖症。實際上，最近研究記錄，使用外源性胰島素將血糖維持在不高於110 mg/分升之濃度，以降低外科重症監護室中重症病患者之發病率及死亡率，無論該等患者是否有糖尿病史(Van den Berghe等人N Engl J Med.,345(19):1359,(2001))。因此，本發明FGF21之變體特別適於幫助恢復代謝不穩定重症病患者之代謝穩定性。FGF21之變體獨特之原因於其刺激葡萄糖攝取並增強胰島素敏感性，但不會誘導低血糖症。
    在本發明之另一態樣中，涵蓋FGF21之變體用作治療1型及2型糖尿病、肥胖症、代謝症候群或重症病患者之藥劑。
    現已詳細闡述本發明，藉由參照以下實例將更充分地理解本發明，該等實例僅出於闡釋目的以此方式包括且不欲限制本發明。
    除非另外指明，否則本發明之實踐將採用業內技術的習用化學方法、生物化學方法、分子生物學方法、免疫學方法及藥理學方法。文獻中對此等技術已充分闡釋。例如，參見Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania: Mack Publishing Company,1990)；Methods In Enzymology(S. Colowick及N. Kaplan編輯，Academic Press公司)；及Handbook of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M. Weir及C.C. Blackwell編輯，1986,Blackwell Scientific Publications)；及Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版，1989)。 位點特異性FGF21突變體
    術語「位點特異性FGF21突變體」或「經取代之FGF21突變體」係指胺基酸序列與天然FGF21多肽序列(例如，SEQ ID NO:1)及其變體之胺基酸序列不同之FGF21突變體多肽。位點特異性FGF21突變體可藉由在FGF21多肽之特定位置引入保守或非保守胺基酸取代及使用天然或非天然胺基酸來產生。
    「保守胺基酸取代」可涉及用非天然殘基(即，野生型FGF21多肽序列之給定位置中未發現之殘基)取代天然胺基酸殘基(即，野生型FGF21多肽序列之給定位置中發現之殘基)，以使得對該位置之胺基酸殘基之極性或電荷幾乎無效應。保守胺基酸取代亦涵蓋通常藉由化學肽合成而非藉由生物學系統中之合成納入之非天然胺基酸殘基。其包括擬肽及胺基酸部分之其他相反或倒轉形式。
    可基於常見側鏈性質將天然殘基分為以下各類：
    (1)疏水性：正白氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
    (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；
    (3)酸性：Asp、Glu；
    (4)鹼性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
    (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；
    (6)芳香族：Trp、Tyr、Phe；及
    (7)硒半胱胺酸、吡咯離胺酸(PYL)及吡咯啉-羧基-離胺酸(PCL)。
    保守取代可涉及用該等種類中一者之一個成員交換同一種類之另一成員。非保守取代可涉及用該等種類中一者之一個成員交換另一種類之一個成員。
    期望胺基酸取代(無論保守或非保守)可由熟習此項技術者在期望此等取代時確定。 截短之FGF21多肽
    本發明之一個實施例係關於成熟FGF21多肽(SEQ ID NO:3)之截短形式。本發明之此實施例源自對鑑別能夠提供與成熟FGF21多肽之未截短形式相似且在一些情形下優於其之活性之經截短FGF21多肽的努力。
    本文所用術語「截短之FGF21多肽」係指FGF21多肽，其中已自FGF21多肽之胺基端(或N-端)去除胺基酸殘基，已自FGF21多肽之羧基端(或C-端)去除胺基酸殘基，或已自FGF21多肽之胺基端及羧基端二者去除胺基酸殘基。如本文所述製備本文所揭示之各種截短。
    N-端截短之FGF21多肽及C-端截短之FGF21多肽之活性可使用活體外磷酸-ERK分析來分析。可用於檢查截短之FGF21多肽之活性之活體外分析的具體詳細內容可參見各實例。
    亦可在活性內分析(例如ob/ob小鼠)中評估本發明之截短之FGF21多肽的活性。通常，為評估截短之FGF21多肽之活體內活性，可將截短之FGF21多肽經腹膜內投與測試動物。在期望培育時段(例如，1小時或更長)後，可抽取血液試樣，且可量測血糖濃度。
    a.　N-端截短
    在本發明之一些實施例中，N-端截短包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個來自成熟FGF21多肽之N-端之胺基酸殘基。具有少於9個胺基酸殘基之N-端截短的截短之FGF21多肽保持成熟FGF21多肽降低個體之血糖之能力。因此，在具體實施例中，本發明涵蓋具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個胺基酸殘基之N-端截短之成熟FGF21多肽或FGF21蛋白質變體的截短形式。
    b.　C-端截短
    在本發明之一些實施例中，C-端截短包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個來自成熟FGF21多肽之C-端之胺基酸殘基。具有少於13個胺基酸殘基之C-端截短之截短之FGF21多肽在活體外ELK-螢光素酶分析中展現野生型FGF21之至少50%功效之功效(Yie J.等人FEBS Letts 583:19-24(2009))，從而表明該等FGF21突變體保持成熟FGF21多肽降低個體之血糖之能力。因此，在具體實施例中，本發明涵蓋具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個胺基酸殘基之C-端截短之成熟FGF21多肽或FGF21蛋白質變體的截短形式。
    c.　N-端及C-端截短
    在本發明之一些實施例中，截短之FGF21多肽可具有N-端與C-端截短之組合。具有N-端與C-端截短之組合的截短之FGF21多肽共有單獨具有N-端或C-端截短之對應截短FGF21多肽之活性。換言之，具有少於9個胺基酸殘基之N-端截短與少於13個胺基酸殘基之C-端截短二者的截短之FGF21多肽的降血糖活性與具有少於9個胺基酸殘基之N-端截短的截短之FGF21多肽或具有少於13個胺基酸殘基之C-端截短的截短之FGF21多肽相似或比其大。因此，在具體實施例中，本發明涵蓋具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個胺基酸殘基之N-端截短與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個胺基酸殘基之C-端截短二者之成熟FGF21多肽或FGF21蛋白質變體之截短形式。
    與所有本發明之FGF21變體一樣，截短之FGF21多肽可視情況包含可藉由定向突變或因細菌表現過程引入之胺基端甲硫胺酸殘基。
    本發明之截短之FGF21多肽可如本文所述實例中所述製備。熟悉標準分子生物學技術之熟習此項技術者可採用結合本發明揭示內容之知識來製備並使用本發明之截短之FGF21多肽。標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養及轉形(例如，電穿孔、脂質轉染)。例如，參見Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，見上文，其出於任何目的以引用方式併入本文中。酶促反應及純化技術可根據製造商說明書實施，如業內習用方法達成，或如本文所述達成。除非提供具體定義，否則結合本文所述之分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學所用之命名及實驗室程序及技術為業內所熟知且習用者。標準技術可用於化學合成；化學分析；醫藥製備、調配及遞送；及患者之治療。
    本發明之截短之FGF21多肽亦可融合至可賦予截短之FGF21多肽額外性質的另一實體。在本發明之一個實施例中，截短之FGF21多肽可融合至IgG恆定結構域或其片段(例如，Fc區域)、人類血清白蛋白(HSA)或白蛋白結合多肽。此融合可使用已知分子生物學方法及/或本文所提供導則達成。此等融合多肽之益處以及製備此等融合多肽之方法更詳細地論述於本文中。 FGF21融合蛋白質
    本文所用術語「FGF21融合多肽」或「FGF21融合蛋白質」係指本文所述任一FGF21蛋白質變體之N-端或C-端處一或多個胺基酸殘基之融合物(例如異源蛋白質或肽)。
    異源肽及多肽包括(但不限於)允許檢測及/或分離FGF21蛋白質變體之表位；跨膜受體蛋白質或其一部分，例如細胞外結構域或跨膜及細胞內結構域；配體或其結合跨膜受體蛋白質之一部分；酶或其催化活性部分；促進寡聚之多肽或肽，例如白胺酸拉鏈結構域；增加穩定性之多肽或肽，例如免疫球蛋白恆定區域；功能或非功能抗體或其重鏈或輕鏈；及具有不同於本發明之FGF21蛋白質變體之活性(例如治療活性)之多肽。本發明亦涵蓋融合至人類血清白蛋白(HSA)之FGF21突變體。
    FGF21融合蛋白質可藉由在FGF21蛋白質變體之N-端或C-端處融合異源序列製得。本文所述異源序列可為胺基酸序列或含有非胺基酸之聚合物。異源序列可直接或經由連接體或銜接體分子融合至FGF21蛋白質變體。連接體或銜接體分子可為一或多個胺基酸殘基(或-體)，例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個殘基(或-體)個，較佳來自10個至50個胺基酸殘基(或-體)，例如，10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個或50個殘基(或-體)，且更佳來自15個至35個胺基酸殘基(或-體)。連接體或銜接體分子亦可經設計具有DNA限制性核酸內切酶或蛋白酶之解離位點以使融合部分分離。
    a.　Fc融合
    在本發明之一個實施例中，FGF21蛋白質變體融合至人類IgG之Fc區域之一或多個結構域。抗體包含兩個功能獨立部分，即結合抗原之可變結構域(稱作「Fab」)及參與效應子功能(例如補體活化)且由吞噬細胞攻擊之恆定結構域(稱作「Fc」)。Fc具有長血清半衰期，而Fab係短暫的(Capon等人，1989,Nature 337: 525-31)。當與治療蛋白質結合在一起時，Fc結構域可提供較長半衰期或納入諸如受體結合、蛋白質A結合、補體固定及可能甚至胎盤轉移等功能(Capon等人，1989)。
    活體內藥物代謝動力學分析顯示人類FGF21因快速清除及活體內降解而在小鼠中具有約0.5至1小時之短半衰期。因此，為延長FGF21之半衰期，將Fc序列融合至FGF21多肽之N-或C-端。Fc區域與野生型FGF21之融合、尤其Fc與野生型FGF21之N-端之融合並未按預期延長半衰期，然而，此使得可研究FGF21在活體內之蛋白質水解降解並鑑別抗此降解之FGF21突變體。
    在本發明內，Fc-FGF21係指Fc序列融合至FGF21之N-端之融合蛋白質。類似地，在本發明內，FGF21-Fc係指Fc序列融合至FGF21之C-端之融合蛋白質。
    可藉由(例如)使用蛋白質A親和管柱來純化所得FGF21融合蛋白質。已發現融合至Fc區域之肽及蛋白質展現比未融合對應部分實質上更長之活體內半衰期。此外，與Fc區域之融合可使融合多肽二聚體化/多聚體化。Fc區域可為天然Fc區域，或可經改變以改良某些品質，例如治療品質、循環時間或減少之聚集。
    蛋白質治療劑藉由與抗體之「Fc」結構域融合之有用修飾詳細地論述於國際公開案第WO 00/024782號中，其全部內容以引用方式併入本文中。此文件論述與「媒劑」(例如聚乙二醇(PEG)、葡聚糖或Fc區域)之連接。
    b.　融合蛋白質連接體
    當形成本發明之融合蛋白質時，可(但未必)應用連接體。當存在時，連接體之化學結構可並不重要，此乃因其主要用作間隔體。連接體可由藉由肽鍵連接在一起之胺基酸構成。在本發明之一些實施例中，連接體係由1個至20個藉由肽鍵連接之胺基酸構成，其中該等胺基酸選自20種天然胺基酸。在各實施例中，1個至20個胺基酸係選自甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸及離胺酸。在一些實施例中，連接體由大多數不受空間位阻之胺基酸(例如甘胺酸及丙胺酸)構成。在一些實施例中，連接體係聚甘胺酸、聚丙胺酸、甘胺酸與丙胺酸之組合(例如聚(Gly-Ala))或甘胺酸與絲胺酸之組合(例如聚(Gly-Ser))。儘管已發現15個胺基酸殘基之連接體尤其適於FGF21融合蛋白質，但本發明涵蓋任一長度或組成之連接體。
    本文所述連接體係實例性的，且本發明涵蓋更長且包括其他殘基之連接體。本發明亦涵蓋非肽連接體。舉例而言，可使用(例如)烷基連接體。該等烷基連接體可進一步經任一非空間位阻基團取代，該基團包括(但不限於)低碳烷基(例如，C1-C6)、低碳醯基、鹵素(例如，Cl、Br)、CN、NH2或苯基。實例性非肽連接體係聚乙二醇連接體，其中該連接體之分子量為100至5000 kD，例如，100至500 kD。 經化學修飾之FGF21突變體
    在給定本文所述揭示內容下，熟習此項技術者可製備本文所述FGF21蛋白質變體之化學修飾形式，包括本文所述FGF21之截短形式。此等經化學修飾之FGF21突變體經改變以使得經化學修飾之FGF21突變體在天然附接至FGF21突變體之分子之類型或位置上不同於未經修飾之FGF21突變體。經化學修飾之FGF21突變體可包括藉由缺失一或多個天然附接之化學基團形成之分子。
    在一個實施例中，本發明之FGF21蛋白質變體可藉由共價附接一或多種聚合物來修飾。舉例而言，所選聚合物通常為水溶性的，以使其所附接之蛋白質不會在水性環境(例如生理環境)中沉澱。在適宜聚合物之範圍內包括聚合物混合物。較佳地，對於終產物製劑之治療用途而言，聚合物將為醫藥上可接受的。與本發明之FGF21蛋白質變體偶聯之非水溶性聚合物亦形成本發明之一態樣。
    實例性聚合物皆可具有任一分子量且可具支鏈或不具支鏈。該等聚合物之平均分子量通常皆介於約2 kDa至約100 kDa之間(術語「約」顯示在水溶性聚合物之製劑中，一些分子將較重且一些分子將小於所述分子量)。每一聚合物之平均分子量較佳介於約5 kDa與約50 kDa之間、更佳介於約12 kDa與約40 kDa之間且最佳介於約20 kDa與約35 kDa之間。
    適宜水溶性聚合物或其混合物包括(但不限於)N-連接或O-連接之碳水化合物、糖、磷酸鹽、聚乙二醇(PEG)(包括PEG之已用於衍化蛋白質之形式，包括單-(C1-C10)、烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇)、單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖(例如，約6 kD之低分子量葡聚糖)、纖維素、或其他基於碳水化合物之聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)及聚乙烯醇。本發明亦涵蓋可用於製備共價附接之FGF21蛋白質變體多聚體之雙官能團交聯分子。本發明亦涵蓋共價附接至多唾液酸之FGF21突變體。
    在本發明之一些實施例中，FGF21突變體經共價或化學修飾以包括一或多種水溶性聚合物，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、聚氧乙二醇或聚丙二醇。例如，參見美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號及第4,179,337號。在本發明之一些實施例中，FGF21突變體包含一或多種聚合物，包括(但不限於)單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纖維素、另一基於碳水化合物之聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇或此等聚合物之混合物。
    在本發明之一些實施例中，FGF21突變體經PEG亞單位共價修飾。在一些實施例中，一或多種水溶性聚合物在FGF21突變體之一或多個特定位置(例如在N-端)處結合。在一些實施例中，一或多種水溶性聚合物隨機附接至FGF21突變體之一或多條側鏈。在一些實施例中，使用PEG來改良FGF21突變體之治療能力。某些此等方法論述於(例如)美國專利第6,133,426號中，其出於任何目的以引用方式併入本文中。
    在聚合物為PEG之本發明實施例中，PEG基團可具有任何便利分子量，且可為直鏈或支鏈。PEG基團之平均分子量較佳將在約2 kD至約100 kDa且更佳約5 kDa至約50 kDa之範圍內，例如，10 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa或50 kDa。PEG基團通常將藉助PEG部分上之反應性基團(例如，醛基、胺基、硫醇基或酯基)至FGF21突變體上之反應性基團(例如，醛基、胺基或酯基)經由醯基化或還原性烷基化附接至FGF21突變體。
    具支鏈PEG衍生物(亦稱作「Y形」PEG衍生物)含有兩個附接至中心核之直鏈甲氧基PEG鏈。該等「Y形」PEG衍生物之空間龐大結構將促進經修飾分子之單點附接。舉例而言，三種「Y形」PEG衍生物係Y-NHS-40K(用於胺聚乙二醇化)；Y-MAL-40K(用於硫醇聚乙二醇化)；及Y-ALD-40K(例如，Y-AALD-40K及Y-PALD-40K)(用於N-端聚乙二醇化)。對於胺聚乙二醇化而言，「Y形」NHS酯將與離胺酸之胺基或生物學活性分子中之N-端胺反應以產生穩定醯胺連接。此NHS酯將在pH 7-8下與目標分子偶合。對於硫醇聚乙二醇化而言，「Y形」馬來醯亞胺將與生物學活性分子中之硫醇基反應以產生穩定之3-硫代琥珀酸亞胺醚連接。此馬來醯亞胺將在pH 5.0-6.5下在其他官能團存在下與目標分子偶合。對於N-端聚乙二醇化而言，「Y形」醛較佳將在諸如氰基硼氫化鈉等還原試劑存在下與生物學活性分子中之N-端胺反應以產生穩定胺連接。此醛將在pH 5-8下與目標分子之N-端胺反應。實施具支鏈聚乙二醇化之試劑可購自(例如)JenKem Technology。
    多肽(包括本發明之FGF21突變體)之聚乙二醇化可使用業內已知之任一聚乙二醇化反應來特定地實施。此等反應闡述於(例如)以下參考文獻中：Francis等人，1992，Focus on Growth Factors 3: 4-10；歐洲專利第0154316號及第0401384號；及美國專利第4,179,337號。舉例而言，聚乙二醇化可經由與反應性聚乙二醇分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯基化反應或烷基化反應來實施，如本文所述。對於醯基化反應而言，所選聚合物應具有單一反應性酯基團。對於還原性烷基化而言，所選聚合物應具有單一反應性醛基。反應性醛係(例如)水溶性聚乙二醇丙醛或其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(例如，參見美國專利第5,252,714號)。
    在本發明之一些實施例中，將PEG基團附接至多肽之有用策略涉及經由在溶液中形成偶聯物連接來組合肽與PEG部分，該等部分各具有相互具有反應性之特別功能團。可容易地利用習用固相合成製備該等肽。該等肽經「預先活化」，在特定位點具有適當官能團。對前體實施純化且充分表徵，然後與PEG部分反應。肽與PEG之連接一般發生於水相中且可容易地藉由反相分析型HPLC監測。聚乙二醇化肽可容易地藉由製備型HPLC純化且藉由分析型HPLC、胺基酸分析及雷射解吸質譜表徵。
    多糖聚合物係另一類可用於蛋白質修飾之水溶性聚合物。因此，融合至多糖聚合物之本發明之FGF21突變體形成本發明實施例。葡聚糖係包含葡萄糖之主要由α1-6連接之個別亞單位的多糖聚合物。葡聚糖本身可以許多分子量範圍獲得，且容易地以約1 kD至約70 kD之分子量獲得。葡聚糖係本身用作媒劑或與另一媒劑(例如，Fc)組合使用之適宜水溶性聚合物。例如，參見國際公開案第WO 96/11953號。已報導使用與治療或診斷免疫球蛋白偶聯之葡聚糖。例如，參見歐洲專利公開案第0315456號，其以引用方式併入本文中。本發明亦涵蓋使用約1 kD至約20 kD之葡聚糖。
    一般而言，可在用於使蛋白質與活化聚合物分子反應之任一適宜條件下實施化學修飾。用於製備經化學修飾之多肽之方法通常可包含以下步驟：(a)　在FGF21蛋白質變體變得附接至一或多種聚合物分子之條件下使多肽與活化聚合物分子(例如聚合物分子之反應性酯或醛衍生物)反應，及(b)　獲得反應產物。最佳反應條件可基於已知參數及期望結果來確定。舉例而言，聚合物分子與蛋白質之比率愈大，所附接聚合物分子之百分比愈大。在本發明之一個實施例中，經化學修飾之FGF21突變體可在胺基端具有單一聚合物分子部分(例如，參見美國專利第5,234,784號)。
    在本發明之另一實施例中，可將FGF21蛋白質變體化學偶合至生物素。然後使生物素/FGF21蛋白質變體結合抗生物素蛋白(avidin)，以產生四價抗生物素蛋白/生物素/FGF21蛋白質變體。亦可將FGF21蛋白質變體共價偶合至二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)且用抗DNP或抗TNP-IgM沉澱所得偶聯物以形成化合價為10之十體偶聯物。
    通常，可藉由投與本發明經化學修飾之FGF21突變體減輕或調節之病況包括本文所述用於FGF21蛋白質變體者。然而，本文所揭示經化學修飾之FGF21突變體與未經修飾之FGF21突變體相比可具有額外活性、增強或降低之生物學活性或其他特性，例如延長或縮短之半衰期。 FGF21突變體之治療組合物及其投與
    包含FGF21突變體之治療組合物在本發明範圍內，且因鑑別出若干展現增強性質之突變體FGF21序列而明確涵蓋。此等FGF21突變體醫藥組合物可包含治療有效量之FGF21蛋白質變體與醫藥或生理上可接受之調配劑之混合物，該調配劑係針對與投與模式之適宜性來選擇。
    可接受之調配材料較佳在所用劑量及濃度下對接受者無毒。
    醫藥組合物可含有調配材料，其用於調節、維持或保持(例如)組合物之pH、容積滲透濃度、黏度、透明度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透。適宜調配材料包括(但不限於)胺基酸(例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉、或亞硫酸氫鈉)、緩衝劑(例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)、增積劑(例如甘露醇或甘胺酸)、螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、錯合劑(例如咖啡因(caffeine)、聚乙烯基吡咯啶酮、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精)、填充劑、單糖、二糖及其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、矯味劑及稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(例如聚乙烯基吡咯啶酮)、低分子量多肽、形成鹽之抗衡離子(例如鈉)、防腐劑(例如苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或潤濕劑(例如普流尼克(pluronic)；PEG；山梨醇酐酯；聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；曲拉通(triton)；胺丁三醇(tromethamine)；卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、穩定性增強劑(例如蔗糖或山梨醇)、張力增強劑(例如鹼金屬鹵化物；較佳氯化鈉或氯化鉀；或甘露醇山梨醇)、遞送媒劑、稀釋劑、賦形劑及/或醫藥佐劑(例如，參見Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，A. R. Gennaro編輯，Mack Publishing公司1990)及其後續版本，其出於任何目的以引用方式併入本文中)。
    熟習此項技術者可根據(例如)預定投與途徑、遞送模式及期望劑量確定最佳醫藥組合物(例如，參見Remington's Pharmaceutical Sciences，見上文)。此等組合物可影響FGF21蛋白質變體之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。
    存於醫藥組合物中之主要媒劑或載劑本質上可為水性或非水性。舉例而言，注射用適宜媒劑或載劑可為水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，其可能補充有供非經腸投與之組合物中常見之其他材料。與血清白蛋白混合之中性緩衝鹽水或鹽水係其他實例性媒劑。其他實例性醫藥組合物包含約pH 7.0-8.5之Tris緩衝液或約pH 4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液，其可進一步包括山梨醇或適宜替代物。在本發明之一個實施例中，可藉由以凍乾餅或水溶液形式混合所選具有期望純度之組合物與可選調配劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，見上文)來製備儲存用FGF21蛋白質變體組合物。此外，可使用適當賦形劑(例如蔗糖)將FGF21蛋白質變體產物調配為凍乾物。
    FGF21蛋白質變體醫藥組合物可經選擇用於非經腸遞送。或者，組合物可經選擇用於吸入或用於經由消化道(例如經口)遞送。此等醫藥上可接受之組合物之製備屬於此項技術範圍內。
    調配物組份以投與位點可接受之濃度存在。舉例而言，使用緩衝劑將組合物維持在生理pH或略低pH，通常在約5至約8之pH範圍內。
    當涵蓋非經腸投與時，用於本發明中之治療組合物可呈無熱原、非經腸可接受之水溶液形式，其包含存於醫藥上可接受之媒劑中之期望FGF21蛋白質變體。尤其適宜之用於非經腸注射之媒劑係無菌蒸餾水，其中FGF21蛋白質變體調配為經適當防腐處理之無菌、等張溶液。再一製備可涉及用諸如以下等試劑調配期望分子：可注射微球體、生物可蝕性粒子、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體，該試劑提供隨後可經由儲積注射遞送之產物之受控或持續釋放。亦可使用透明質酸，且此可具有促進循環持續時間之效應。引入期望分子之其他適宜手段包括可植入藥物遞送裝置。
    在一個實施例中，可將醫藥組合物調配用於吸入。舉例而言，可將FGF21蛋白質變體調配為乾燥粉末用於吸入。亦可用推進劑將FGF21蛋白質變體吸入溶液調配用於氣溶膠遞送。在再一實施例中，溶液可經霧化。肺投與進一步闡述於國際公開案第WO 94/20069中，其闡述經化學修飾之蛋白質之肺遞送。
    亦涵蓋某些調配物可經口投與。在本發明之一個實施例中，以此方式投與之FGF21蛋白質變體可利用或不利用通常用於固體劑型(例如錠劑及膠囊)之複合中之載劑調配。舉例而言，膠囊可經設計以在胃腸道中某時釋放調配物之活性部分，此時可使生物利用度最大化且使全身前降解最小化。可包括其他試劑以促進FGF21蛋白質變體之吸收。亦可採用稀釋劑、矯味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
    另一醫藥組合物可涉及有效量之FGF21蛋白質變體與適於製造錠劑之無毒賦形劑之混合物。藉由在無菌水或另一適當媒劑中溶解錠劑，可以單位劑型製備溶液。適宜賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠(acacia)；或潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。
    熟習此項技術者應瞭解其他FGF21蛋白質變體醫藥組合物，包括涉及存於持續或受控遞送調配物中之FGF21蛋白質變體之調配物。用於調配多種其他持續或受控遞送手段(例如脂質體載劑、生物可蝕性微粒子或多孔珠粒及儲積注射)之技術亦為熟習此項技術者已知(例如，參見國際公開案第WO 93/15722號，其闡述遞送醫藥組合物之多孔聚合微粒子之受控釋放；及Wischke & Schwendeman,2008,Int. J Pharm. 364: 298-327；及Freiberg & Zhu,2004,Int. J Pharm. 282: 1-18，其論述微球體/微粒子之製備及應用)。
    持續釋放製劑之其他實例包括呈成形物件形式之半透性聚合物基質，例如膜或微膠囊。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(美國專利第3,773,919號及歐洲專利第0058481號)、L-麩胺酸與L-麩胺酸-γ-乙酯之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 22: 547-56)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)(Langer等人，1981,J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277及Langer,1982,Chem. Tech. 12: 98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，見上文)或聚-D-3-羥基丁酸(歐洲專利第0133988號)。持續釋放組合物亦可包括脂質體，其可藉由若干業內已知方法中之任一者製備。例如，參見Epstein等人，1985,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92；及歐洲專利第0036676號、第0088046號及第0143949號。
    欲用於活體內投與之FGF21蛋白質變體醫藥組合物通常必須為無菌。此可藉由過濾經由無菌過濾膜達成。倘若組合物係凍乾的，則使用此方法之滅菌可在凍乾及重構成之前或之後實施。用於非經腸投與之組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。另外，通常將非經腸組合物置於具有無菌進入孔之容器(例如，靜脈內溶液袋或具有可用皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)中。
    在已調配醫藥組合物後，可將其以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或水合或凍乾粉末形式儲存在無菌小瓶中。此等調配物可以即用(ready-to-use)形式或需要在投與前重構成之形式(例如，凍乾)儲存。
    在一具體實施例中，本發明係關於產生單劑量投與單元之套組。該等套組皆可含有具有乾燥蛋白質之第一容器與具有水性調配物之第二容器二者。本發明範圍內亦包括含有單及多室預填充注射器(例如，液體注射器及溶解注射器(lyosyringe))之套組。
    欲在治療上採用之FGF21蛋白質變體醫藥組合物之有效量應取決於(例如)治療背景及目標。因此，熟習此項技術者應瞭解，用於治療之適當劑量量應部分地視所遞送分子、FGF21蛋白質變體所用之適應症、投與途徑及患者之大小(體重、體表面積或器官大小)及狀況(年齡及一般健康情況)而變化。因此，臨床醫生可滴定劑量並調節投與途徑以獲得最佳治療效應。典型劑量可在約0.1 μg/kg至最高約100 mg/kg或更多之範圍內，此取決於上述因素。在其他實施例中，劑量可在0.1 μg/kg直至約100 mg/kg之範圍內；或1 μg/kg直至約100 mg/kg之範圍內；或5 μg/kg、10 μg/kg、15 μg/kg、20 μg/kg、25 μg/kg、30 μg/kg、35 μg/kg、40 μg/kg、45 μg/kg、50 μg/kg、55 μg/kg、60 μg/kg、65 μg/kg、70 μg/kg、75 μg/kg直至約100 mg/kg之範圍內。在再一實施例中，劑量可為50 μg/kg、100 μg/kg、150 μg/kg、200 μg/kg、250 μg/kg、300 μg/kg、350 μg/kg、400 μg/kg、450 μg/kg、500 μg/kg、550 μg/kg、600 μg/kg、650 μg/kg、700 μg/kg、750 μg/kg、800 μg/kg、850 μg/kg、900 μg/kg、950 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg、300 μg/kg、400 μg/kg、500 μg/kg、600 μg/kg、700 μg/kg、800 μg/kg、900 μg/kg、1000 μg/kg、2000 μg/kg、3000 μg/kg、4000 μg/kg、5000 μg/kg、6000 μg/kg、7000 μg/kg、8000 μg/kg、9000 μg/kg或10 mg/kg。
    給予頻率應取決於所用調配物中FGF21蛋白質變體之藥物代謝動力學參數。通常，臨床醫生應投與組合物直至達到達成期望效應之劑量。因此，可以單一劑量形式、隨時間以兩次或更多次劑量(其可或可不含有相同量之期望分子)形式或以連續輸注形式經由植入裝置或導管投與組合物。適當劑量之進一步精化常規由熟習此項技術者進行且屬於其所常規實施之任務範圍內。適當劑量可藉助使用適當劑量反應數據來確定。
    醫藥組合物之投與途徑係根據已知方法，例如，經口；經由藉由靜脈內、腹膜內、大腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內、或病灶內途徑注射；藉由持續釋放系統(其亦可經注射)；或藉由植入裝置。倘若需要，則該等組合物可藉由濃注或藉由輸注連續地、或藉由植入裝置投與。
    或者或另外，可經由植入上面已吸收或囊封有期望分子之膜、海綿或另一適當材料來局部地投與組合物。倘若使用植入裝置，則可將該裝置植入任一適宜組織或器官中，且期望分子之遞送可經由擴散、定時釋放推注或連續投與。 FGF21多肽突變體之治療用途
    FGF21蛋白質變體可用於治療、診斷、改善或預防眾多疾病、病症或病況，包括(但不限於)代謝障礙。在一個實施例中，欲治療之代謝障礙係糖尿病，例如，2型糖尿病。在另一實施例中，代謝障礙係肥胖症。其他實施例包括代謝病況或病症，例如1型糖尿病、胰腺炎、異常血脂症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症候群、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎臟疾病、糖尿病併發症、神經病變、胃輕癱及其他代謝障礙。
    應用時，諸如1型或2型糖尿病或肥胖症等病症或病況可藉由向有需要之患者投與治療有效劑量量之如本文所述FGF21蛋白質變體來治療。可如本文所述實施投與，例如藉由IV注射、腹膜內注射、肌內注射或以錠劑或液體形式經口。大多數情形下，期望劑量可如本文所述由臨床醫師確定，且可代表FGF21突變體多肽之治療有效劑量。熟習此項技術應明瞭，FGF21突變體多肽之治療有效劑量將尤其取決於投與方案、所投與抗原之單位劑量、核酸分子或多肽是否與其他治療劑組合投與、接受者之免疫狀態及健康狀況。本文所用術語「治療有效劑量」意指研究人員、醫師或另一臨床醫生所尋求的誘發組織系統、動物或人類中之生物學或醫學反應之FGF21突變體多肽之量，該反應包括所治療疾病或病症之症狀之減輕。 醫藥組合物
    本發明亦提供包含一或多種本文所述FGF21變體或突變體及醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。在一些實施例中，該等醫藥組合物係製備呈注射之液體溶液或懸浮液；亦可製備呈適於在注射前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式。脂質體包括於醫藥上可接受之載劑的定義中。醫藥上可接受之鹽亦可存於醫藥組合物中，例如無機酸鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及諸如此類)；及有機酸鹽(例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽及諸如此類)。醫藥上可接受之賦形劑之詳盡論述見於Remington: The Science and Practice of Pharmacy(1995) Alfonso Gennaro,Lippincott,Williams,& Wilkins。 融合蛋白質及衍生自FGF21之肽化合物
    在另一實施例中，可將本發明之FGF21變體製成衍生自FGF21變體胺基酸序列之融合蛋白質或肽化合物。此等融合蛋白質及肽化合物可使用業內已知之標準技術製得。舉例而言，肽化合物可藉由化學合成使用標準肽合成技術製得且隨後藉由將肽引入細胞中之多種業內已知手段(例如，脂質體及諸如此類)引入細胞中。
    本發明之融合蛋白質或肽化合物之活體內半衰期可藉由進行肽修飾來改良，例如將N-連接之糖基化位點添加至FGF21變體中，或將FGF21變體偶聯至聚(乙二醇)(PEG；聚乙二醇化)，例如，經由離胺酸-單聚乙二醇化或半胱胺酸-單聚乙二醇化。已證明此等技術在延長治療蛋白質藥物之半衰期上有益。預期本發明之FGF21變體之聚乙二醇化可產生相似醫藥優點。
    另外，聚乙二醇化可在本發明多肽之任一部分中藉由引入非天然胺基酸來達成。某些非天然胺基酸可藉由闡述於以下文獻中之技術引入：Deiters等人，J Am Chem Soc 125:11782-11783,2003；Wang及Schultz,Science 301:964-967,2003；Wang等人，Science 292:498-500,2001；Zhang等人，Science 303:371-373,2004或美國專利第7,083,970號。簡言之，該等表現系統中之一些涉及定點誘變以將無義密碼子(例如琥珀型TAG)引入編碼本發明多肽之開放閱讀框中。然後將此等表現載體引入可利用對所引入無義密碼子具有特異性且填充有所選非天然胺基酸之tRNA之宿主中。有益於將部分偶聯至本發明多肽之目的之具體非天然胺基酸包括具有乙炔及疊氮側鏈者。隨後含有該等新穎胺基酸之FGF21變體可在蛋白質中之該等所選位點處聚乙二醇化。 實例實例1：FGF21變體蛋白質之製備及聚乙二醇化.
    FGF21變體之表現構築體：將FGF21變體選殖至經修飾大腸桿菌表現載體pET30a(由Achmuller等人(2007)(Nature Methods 4:1037-1043)闡述)中，以與FGF21之N-端(aa 33-209)處之六組胺酸標籤、隨後Npro-EDDIE標籤產生框架內融合物。
    FGF21變體之表現及純化：將pET30a-His-Npro-EDDIE-FGF21表現質粒轉形至大腸桿菌BL21 Star(DE3)感受態細胞(Invitrogen)中。在37℃下在含有50 μg/mL卡那黴素(kanamycin)之50 mL極品肉湯(Terrific Broth)(TB)中實施剛剛轉形之細胞之單菌落的過夜生長。將預培養物轉移至具有卡那黴素之1 L TB培養基中且在37℃下在以250 rpm振盪的同時在帶擋板燒瓶中培養。在培養6小時後，藉由以1 mM之最終濃度添加IPTG來誘導FGF21之表現，且使培養物在37℃下生長過夜。然後收穫細胞且將其再懸浮於50 mL冰冷溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl,pH 8,150 mM NaCl,1 mM EDTA)中，隨後使用microfluidizerTM溶解。
    藉由在4℃下以30,000 x g離心1小時使包涵體(IB)沉澱。用50 mM Tris-HCl,pH 8,150 mM NaCl洗滌IB且隨後將其溶解於30 mL溶解緩衝液(10 mM Tris-HCl,pH8,100 mM NaH2PO4,6 M GnHCl)中。藉由在25℃下以30,000 x g離心1小時將經溶解IB澄清。將IB溶液加載至用溶解緩衝液平衡之Ni-NTA高性能樹脂之5 mL管柱(GE Healthcare)上。藉由將pH降至4.5來溶析結合該樹脂之蛋白質。藉由調節pH並以20 mM之濃度添加二硫蘇糖醇(DTT)將溶析液條件化。將條件化溶析液緩慢稀釋至1 L再摺疊緩衝液(50 mM Tris-HCl,pH 8,0.5 M精胺酸，20 mM DTT)中，隨後在4℃下培育2天。濃縮稀釋試樣且使用超過濾方法將緩衝液交換為20 mM Tris-HCl(pH 9)。將濃縮試樣加載至用20 mM Tri-HCl(pH 9)平衡之Q瓊脂糖快速流動樹脂之10 mL管柱(GE Healthcare)上。
    在用平衡緩衝液洗滌樹脂後，用20 mM Tris-HCl,pH 9,500 mM NaCl溶析結合樹脂之蛋白質。為自再摺疊FGF21蛋白質去除解離掉之His-Npro融合片段及任何未解離之融合蛋白質，將溶析液加載至用20 mM Tris,pH 8.0,50 mM咪唑平衡之Ni-NTA高性能樹脂之5 mL管柱上，且收集含有FGF21之溢流部分。為降低內毒素濃度，用10 mM Tris,pH 8,50 mM咪唑，500 mM NaCl，1 mM CaCl2平衡之EndoTrap HD樹脂(Hyglos)處理FGF21部分。利用PBS透析低內毒素試樣且隨後用0.22 μm過濾器滅菌。將經純化之FGF21蛋白質在液氮中快速冷凍且儲存於-80℃下。藉由280 nm下之吸光度使用9362 M-1 cm-1作為FGF21之莫耳消光係數來確定蛋白質濃度。藉由HPLC、SDS-PAGE及液相層析-質譜來確定蛋白質純度及完整性。
    FGF21變體之半胱胺酸聚乙二醇化：hsFGF21(R154C)變體具有經由經改造半胱胺酸二聚體化之傾向性；因此，在聚乙二醇化之前，在冰上用5 mM巰基乙胺將蛋白質溶液(通常為5 mg/ml，存於Tris緩衝液中)輕輕還原30分鐘且在20 mM Tris(pH 7)中立即脫鹽。然後在冰上用1.5當量40 kDa具支鏈馬來醯亞胺基-PEG試劑(NOF目錄編號GL2-400 MA，購自Sunbright series)立即將剛剛還原之蛋白質(通常為3 mg/ml)聚乙二醇化3小時。最終藉由陰離子交換層析(MonoQ)純化聚乙二醇化蛋白質，且總體產率為約25%。
    FGF21變體之N-端聚乙二醇化：FGF21變體及40 kDa具支鏈PEG試劑(NOF目錄編號GL2-400AL3，購自Sunbright series；與FGF21之莫耳比為3:1)之最終濃度分別為3-4 mg/mL及9-12 mg/mL。緩衝液係50 mM乙酸鈉(pH 6.0)、25 mM氯化鈉及40 mM氰基硼氫化鈉。在4℃下將反應混合物輕輕翻滾44 hr且經若干時間點監測反應轉化率。20 hr時之近似轉化率係50%且44 hr時之近似轉化率係70%。 實例2：人類FGF21二硫化物變體之產生.
    選殖文庫：藉由在載體pGAPZαA(Invitrogen,Carlsbad,CA)之獨特BamHI位點中添加β-內醯胺酶表現匣(cassette)來修飾該載體。如由Hribar等人(2008)BioTechniques 44:477-84所述產生β-內醯胺酶表現匣。在與N-端序列框內連接之甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶(GAP)啟動子之後將編碼胺基酸33至209之人類FGF21 cDNA選殖至經修飾pGAPZαA載體中，該等N-端序列框內包括α交配因子分泌信號序列、6組胺酸親和力純化標籤及菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶識別序列。產生hFGF21構築體文庫，其中每一構築體具有位於野生型序列中之Cys103及Cys121以及兩個突變為半胱胺酸之野生型胺基酸。藉由利用編碼替代野生型胺基酸之半胱胺酸之引物產生hFGF21胺基酸33-209編碼區域之PCR片段來製備該文庫。PCR片段經設計以使其共有16個彼此相同序列之鹼基對或線性化修飾之pGAPZαA載體，以使其可使用In-Pusion酶(Takara Bio Co USA)結合在一起。對每一構築體進行序列驗證，然後將其用於酵母菌株產生。
    產生酵母菌株：藉由破壞YPS1基因來修飾畢赤酵母菌株SMD1168H(Invitrogen)，如由Yao等人(2009)J Biotechnol. Jan 15;139(2):131-6所述。經修飾菌株(SMD1168HδYPS1)對300 μg/mL殺稻瘟菌素(blasticidin)具有抗性。用Avr II消化約5-10 μg經序列驗證之質粒DNA且將其與SMD1168HδYPS1細胞混合，該等細胞係根據用於pGAPZα-A之Invitrogen手冊製備。將該等細胞與線性化質粒在0.2 cm光析管(Bio-Rad,Hercules,CA)中混合。在冰上將具有細胞及線性化質粒之光析管培育5分鐘。使用Gene Pulser-II(Bio-Rad)對光析管脈衝處理，其中將電壓設定為1.5 kV，電容器設定為25 μF，且脈衝控制器設定為400 Ohm。
    在脈衝後立即將1 mL冰冷1 M山梨醇添加至光析管中，且將其內含物轉移至無菌15 mL管中。不進行振盪將該管在30℃下培育2 h。將電穿孔細胞平鋪於含有100 μg/mL博萊黴素(zeocin)(zeo)之YPDS(1%酵母萃取物，2%蛋白腖，2%右旋糖，1 M山梨醇及2%瓊脂)板上。在30℃下將該等板培育3-10天直至形成菌落。精選每一構築體之24個菌落且將其用於接種存於96孔深孔板中之含有100 μg/mL博萊黴素之1 mL YPD生長培養基。在振盪器(Sheldon Manufacturing,Cornelius,OR)中以900 RPM將該板在30℃下培育過夜。移出每一培養物之10 μL等分試樣且將其稀釋至存於96孔深孔板中之990 μL PBS(pH 7.4)中。
    在比色測定β-內醯胺酶活性時，將50 μL 1:100稀釋培養物轉移至96孔微量滴定板中。將頭孢硝噻(Nitrocefin)(1 mg；EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)溶解於100 μL DMSO中且稀釋至1.9 mL PBS中以獲得1 mM之工作溶液。將頭孢硝噻工作溶液(50 μL)添加至各孔中以達成500 μM之最終濃度。在添加頭孢硝噻後，將該板在室溫下(RT)在黑暗中培育5分鐘。在 Spectramax Plus微量滴定板讀數器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上量測492 nm下之吸光度以確定β-內醯胺酶活性。對於每一構築體而言，製備兩個具有最高β-內醯胺酶活性之菌株之甘油原液且將其儲存於-80℃下。
    hFGF21二硫化物變體之小規模表現及純化：對於每一構築體而言，使用來自兩個具有最高β-內醯胺酶比活性之菌株之hFGF21二硫化物變體甘油原液來接種存於96孔深孔板中之1 mL緩衝複合葡萄糖培養基(1%酵母萃取物，2%蛋白腖，100 mM磷酸鉀，pH 6.0，1.34% YNB，4 x 10-5% 生物素，2%葡萄糖及2%酪蛋白胺基酸)。在以900 RPM振盪(Sheldon Manufacturing,Cornelius,OR)的同時在30℃下使培養物生長約48 h直至細胞生長達到飽和。使用飽和培養物(25 μL)之等分試樣來接種存於24孔深孔板中之5 mL緩衝複合葡萄糖培養基。在振盪器(Sheldon Manufacturing,Cornelius,OR)中以350 RPM將該等板在30℃下培育過夜。在約24 h後，將該等板以2500 x g離心15分鐘。自沉澱細胞吸出培養基且將其添加至具有10 kDa截止膜之Amicon ultra-15離心過濾單元(Millipore,Billerica,MA)中。將10 mL含有10 mM咪唑及1X無Halt EDTA之蛋白酶抑制劑混合液(cocktail)(Thermo,Rockford,IL)之PBS(pH 7.4)添加至存於濃縮器中之培養基中以使總體積達到15 mL。
    在Sorvall Legend RT plus離心機(Thermo)中將過濾單元以4000 RMP離心30分鐘。棄去濃縮器溢流物且將約13 mL PBS(pH 7.4)添加至濃縮培養基中。再將過濾單元以4000 RMP離心30分鐘。將濃縮緩衝液交換試樣加載至鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)旋轉管柱(Qiagen,Valencia,CA)上。在Sorvall Legend Micro 21R離心機(Thermo)中將管柱以270 x g(1600 rpm)離心5分鐘，且隨後用含有10 mM咪唑之600 μL PBS(pH 7.4)洗滌兩次。用含有300 mM咪唑之200 μL PBS(pH 7.4)溶析6 HIS標記之hFGF21變體。
    hFGF21二硫化物變體之中等規模表現及純化：使用來自表現具有最高活性之hFGF21二硫化物變體之菌株(當在兩點pERK細胞分析(10 nM及100 nM)中測試時)的hFGF21二硫化物變體甘油原液來接種存於50 mL無菌管中之含有100 μg/mL博萊黴素之5 mL緩衝複合葡萄糖培養基(1%酵母萃取物，2%蛋白腖，100 mM磷酸鉀，pH 6.0，1.34% YNB，4 x 10-5%生物素，2%葡萄糖及2%酪蛋白胺基酸)。在以250 RPM振盪的同時在30℃下使培養物生長約48 h直至細胞生長達到飽和。使用飽和培養物(50 μL)之等分試樣來接種存於250 mL Ultra Yield燒瓶(Thomson Instrument公司，Oceanside,CA)中之100 mL緩衝複合葡萄糖培養基。在振盪器中以300 RPM將燒瓶在30℃下培育過夜。在約24 h後，將該等細胞以2500 x g離心15分鐘。自沉澱細胞吸出培養基(80 mL)且將其添加至具有10 kDa截止膜之Centricon-70離心過濾單元(Millipore,Billerica,MA)中。在Sorvall Legend RT plus離心機(Thermo)中將過濾單元以4000 RMP離心30分鐘。將剩餘澄清培養基(約20 mL)添加至Centricon-70離心過濾器中且藉由添加含有10 mM咪唑及1X無EDTA之Halt蛋白酶抑制劑混合液之PBS(pH 7.4)將過濾器中之總體積增至80 mL。再將過濾單元以4000 rpm離心30分鐘。藉由添加含有10 mM之PBS(pH 7.4)將過濾單元中濃縮培養基之體積增至80 mL。再將過濾單元以4000 rpm離心30分鐘。
    將濃縮緩衝液交換試樣加載至用含有10 mM咪唑之PBS(pH 7.4)之預平衡之1 mL His-Gravitrap管柱(GE Lifesciences,Piscataway,NJ)上。用含有20 mM咪唑之10 mL PBS(pH 7.4)洗滌管柱。用含有300 mM咪唑之2.5 mLPBS(pH 7.4)溶析6HIS標記之hFGF21變體。將2.5 mL溶析緩衝液施加至用含有10 mM咪唑之25 mL PBS(pH 7.4)預平衡之10 mL PD-10脫鹽管柱。用含有10 mM咪唑之3.5 mL PBS(pH 7.4)自脫鹽管柱溶析6HIS標記之二硫化物變體。
    藉由添加ProTEV蛋白酶(250單位；Promega,Madison,WI)且將試樣在室溫下培育2 h且在4℃下培育過夜自脫鹽親和力純化hFGF21二硫化物變體去除6HIS標籤。將標籤解離之hFGF21二硫化物變體加載至用含有10 mM咪唑之PBS(pH 7.4)預平衡之1 mL His-Gravitrap管柱上。收集含有標籤解離之hFGF21二硫化物變體之溢流物。用含有10 mM咪唑之5 mL PBS(pH 7.4)洗滌His-Gravitrap管柱。收集管柱溢流物且將其添加至來自標籤解離反應之溢流物中。用具有10 kDa截止膜之Amicon ultra-15離心過濾器將合併的溢流試樣(約8.5 mL)濃縮至約1 mL。在-80℃下冷凍經濃縮hFGF21二硫化物變體直至在pERK細胞分析中進行分析。 實例3：量測2-去氧葡萄糖(2-DOG)攝取
    最近，已顯示FGF21在胰島素存在及不存在下刺激小鼠3T3-L1脂肪細胞中之葡萄糖攝取，且以劑量依賴方式降低ob/ob及db/db小鼠及8週齡ZDF大鼠之進食及空腹血糖、甘油三酯及升糖素含量，由此提供使用FGF21作為治療糖尿病及肥胖症之療法之基礎(例如，參見專利公開案WO 03/011213及Kharitonenkov等人，(2005) Jour. of Clinical Invest. 115:1627-1635)。此外，觀察到FGF21刺激3T3-L1脂肪細胞中之FGFR-1及FGFR-2之酪胺酸磷酸化。
    3T3-L1成纖維細胞購自ATCC(目錄編號CL173)。在150 cm培養皿中使該等細胞生長至鋪滿且在補充有10%胎牛血清及1%青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin)之具有高葡萄糖(Invitrogen編號11995065)之DMEM中再維持4天。然後使該等細胞在補充有4 μg/ml胰島素(Sigma目錄編號I-5500)、115 μg/ml IBMX(Sigma目錄編號I5879)及0.0975 μg/ml地塞米松(dexamethasone)(Sigma目錄編號D1756)之上述培養基中分化3天，此後用完全DMEM替換分化培養基。在培養基替換後當天將一板分化3T3-L1脂肪細胞接種於4個96孔板上。
    然後在完全培養基中用FGF21-WT及FGF21變體(變體列表參見表2；30 pM至100 nM係所用典型濃度範圍)將脂肪細胞處理過夜。將用FGF21試樣處理之脂肪細胞在50 μl/孔KRH緩衝液(0.75% NaCl;0.038% KCl;0.0196% CaCl2；0.032% MgSO4；0.025 M Hepes,pH 7.5；0.5% BSA；2 mM丙酮酸鈉)中血清饑餓2小時。向空白用孔中添加1 μl(最終濃度為5 μg/ml)細胞遲緩素B(cytochalasin B)且保持15分鐘。[3H]-2-DOG(20.6 mci/mmol,1 mci/ml)係以1:20稀釋於5.1 mM冷2-DOG中，1 μl經稀釋2-DOG/孔添加至細胞中且培育5分鐘。用100 μl/孔KRH緩衝液將細胞洗滌3次。將40 μl/孔1% SDS添加至細胞中且將該等細胞振盪至少10分鐘。添加200 μl/孔閃爍流體且將該等板振盪過夜並在β-微量板讀數器中讀數。對自用細胞遲緩素B處理之整行/列獲得之值取平均值且自所有其他值減去該等值。藉由GraphPad prism軟體分析數據，其結果匯總於表2中。 表2. 3T3-L1脂肪細胞2-去氧-葡萄糖(2-DOG)攝取分析中FGF21 WT及FGF21變體之EC50值及相對效能(倍數-WT)的匯總

    (1)「倍數-WT」係在同一實驗中「頭對頭(head to head)」實施之FGF21變體與FGF21-WT之EC50之比率。
    實例4：pERK細胞內西方(In Cell Western)(ICW)分析。在DMEM高葡萄糖、10% FBS、1% PS中培養用人類β-可羅素穩定轉染之HEK293細胞且將600 ng/ml G418以30,000個細胞/孔接種於聚-D-離胺酸塗佈之96孔板(BD bioscience,356640)中過夜。將該等細胞在DMEM高葡萄糖、0.5% BSA及10 mM HEPES中血清饑餓4小時。在饑餓培養基中將WT FGF21及FGF21變體(變體列表參見表3)稀釋至不同濃度(100 pM至300 nM係所用典型濃度範圍)。用FGF21將該等細胞刺激10分鐘。在FGF21刺激後，自各孔吸出培養基並用100 μl冷PBS將細胞洗滌一次且隨後在RT下用100 μl 4%甲醛固定15分鐘且隨後與100 μl冰冷甲醇一起再培育10分鐘。
    固定後，用存於PBS中之0.3% Triton X-100將細胞洗滌4次，每次5分鐘。在室溫下將150 μl Odyssey阻斷緩衝液添加至透化細胞中並保持1.5小時。將磷酸-ERK(pERK)抗體稀釋至0.17 μg/ml之濃度(1:200稀釋度或所示稀釋度)，且在Odyssey阻斷緩衝液中將總-ERK(tERK)抗體稀釋至2.2 μg/ml之濃度(1:200稀釋度或所示稀釋度)。向每孔中添加50 μl，省略僅用二級抗體處理之一行以針對背景進行標準化。用濕紙巾及蓋覆蓋該板以防止蒸發且隨後在4℃下培育過夜。
    此後，吸出一級抗體且用存於PBS中之0.3% Tween 20將細胞洗滌4次，每次5分鐘。在洗滌期間，在含有1:1000稀釋度(或所示稀釋度)山羊抗小鼠Alexa 680及1:1000稀釋度(或所示稀釋度)IRDye800山羊抗兔抗體之Odyssey阻斷緩衝液中製備二級抗體反應混合物。在完成洗滌後，將40 μl反應混合物添加至各孔中。用黑蓋覆蓋該等板以保護二級抗體免受光之影響，且在振盪器上將該等板在RT下培育1 hr。最後，用存於PBS中之0.3% Tween 20將細胞再洗滌4次，每次5分鐘，且隨後在LI-COR Bioscience Odyssey紅外線成像系統(Li-Cor Biosciences,Lincoln,NE)上於700 nm(紅光)及800 nm(綠光)通道中進行掃描。Alexa 680利用遠紅螢光(發射波長668 nm)染色tERK，而IRDye800利用綠色螢光(發射波長800 nm)染色pERK。為消除螢光背景，對自僅用二級抗體處理之整行/列獲得之值取平均值且自該板獲得之所有其他值減去該等值。在標準化存在於各試樣中之pERK之量時，用各孔中之pERK之值除以tERK之值。藉由GraphPad prism軟體分析數據，其結果匯總於表3中。 表3.　在pERK細胞分析中使用經人類β-可羅素穩定轉染之HEK293細胞獲得之FGF21 WT及FGF21變體之EC50值及相對效能(倍數-WT)的匯總

    (1)「倍數-WT」係在同一實驗中「頭對頭」實施之FGF21變體之EC50值與FGF21-WT之EC50之比率。
    實例5：FGF21及FGF21變體之活體內測試-藥效學及血漿暴露。 ob/ob小鼠係2型糖尿病之小鼠模型。小鼠缺乏功能瘦素且特徵在於高血糖症、胰島素抗性、過食症、肝脂肪變性及肥胖症。使用雄性ob/ob小鼠(10-13週齡)來量測以下對血糖之效應：(1)野生型FGF21，(2) FGF21變體，(3)聚乙二醇化野生型FGF21及(4)聚乙二醇化FGF21變體。
    每天以1 mg/kg及4 ml/kg經皮下投與一次野生型FGF21、變體FGF21或PBS媒劑，持續5天。在研究第一天，量測尾部血糖及體重且將小鼠分成不同組(n=8隻/組)，其中各組平均葡萄糖及體重相當。在第1天、第3天及第5天給藥前及給藥後2小時及4小時使用血糖儀(OneTouch)量測血糖。該等研究之結果匯總於表4中。 表4.　 ob/ob小鼠在5天篩選研究期間藉由FGF21變體所達成總葡萄糖AUC之降低%

    (1)「相較於WT之倍數變化」係在同一實驗中「頭對頭」實施之FGF21變體之「葡萄糖AUC降低」與FGF21-WT之「葡萄糖AUC降低」的比率。
    每週經皮下向小鼠投與2次1 mg/kg聚乙二醇化FGF21野生型、0.3 mg/kg、1 mg/kg或3 mg/kg聚乙二醇化FGF21變體或4 ml/kg PBS媒劑，持續2週。在研究第一天，量測尾部血糖及體重且將小鼠分成不同組(n=8隻/組)，其中各組平均葡萄糖及體重相當。在第1天、第4天、第8天及第11天給藥前及給藥後4小時使用血糖儀量測血糖。在第2天、第5天、第9天及第12天每次給藥後24小時進行額外血糖量測。在第1天給藥前及第12天最後一次給藥後24小時量測血漿胰島素。在第1天給藥前及第5天第二次給藥後24小時量測血漿甘油三酯。該等研究之結果匯總於表5中。 表5.　 ob/ob小鼠在12天研究期間相對於媒劑藉由聚乙二醇化FGF21野生型(WT)及變體所達成血糖、胰島素、甘油三酯(TG)、體重(BW)增加、肝TG/脂質之變化%
    V76-154C-PEG變體展現極佳活體內代謝特徵，如表5中所發現。V76-154C-PEG與FGF21-WT-R154C-PEG(-7%肝甘油三酯變化，與媒劑對照組沒有顯著不同；圖1)相比亦展現極佳降肝甘油三酯性質(-25%肝甘油三酯變化，與媒劑對照組顯著不同；圖1)。當在同一研究(WT-R154C-PEG，實驗3)中以1 mg/kg給予兩種化合物時，二者之血漿暴露(圖2)係相當的且其他功效端點(總葡萄糖AUC、血漿胰島素、體重增加及血漿甘油三酯)沒有顯著不同。 實例6：利用野生型FGF21及聚乙二醇化FGF21變體進行之血漿穩定性分析
    為確定野生型FGF21(FGF21-WT)與聚乙二醇化FGF21變體相比之血漿穩定性，實施血漿穩定性分析。將十(10) μl FGF21-WT(4.84 mg/ml)及35.5 μl FGF21-V76-154C-PEG(2.12 mg/ml)添加至90 μl及264.5 μl ob/ob小鼠血漿(90%及88%血漿)中。以5等分試樣製備各試樣且將其培育1 hr、4 hr、24 hr、48 hr及72 hr。經血漿處理之試樣儲存在4℃下直至收集來自所有時間點之試樣。將九(9) μl經血漿處理之FGF21-WT及27 μl經血漿處理之FGF21-V76-154C-PEG添加至750 μl培養基(具有1.2%血漿之300 nM FGF21-WT及具有3.6%血漿之450 nM FGF21-V76-154C-PEG)中且在培養基中以1:3連接稀釋8次。用蛋白質將經人類β-可羅素穩定轉染之HEK293細胞處理10分鐘，隨後利用pERK ICW之標準方案進行處理。亦包括未經處理之FGF21-WT、FGF21-V76-154C-PEG及1.2%及3.6%小鼠血漿作為對照。該等實驗之結果以圖表形式繪示於圖3A及3B中。
    FGF21-WT在37℃下與小鼠血漿一起培育時在短時間範圍(1-4小時)內損失活性，而相比之下，V76-154C-PEG在37℃下與小鼠血漿一起培育時保持其完全活性達至少72小時。
    儘管已參照其具體實施例闡述本發明，但熟習此項技術者應瞭解，多種改變可實施並且多種相等物可取代，此並不背離本發明之精神及範圍。另外，可做許多修改以使特定情況、材料、物質組成、方法、一或多個方法步驟適應本發明之目的、精神及範圍。本發明範圍內欲涵蓋所有此等修改。
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    圖1係顯示在用聚乙二醇化野生型FGF21及本發明之FGF21變體治療ob/ob小鼠12天後肝甘油三酯含量之下降之圖示。使用Qiagen組織溶解器(具有一個5 mm珠粒)在比率為1000:5之異丙醇：丁基化羥基甲苯(BHT或2,6-二-第三丁基-4-甲基苯酚)中均質化肝試樣(<50 mg)。在均質化後，在室溫下將試樣輕輕振盪45分鐘且隨後在4℃下以6000 rpm旋轉沉澱10分鐘。收集上清液且使用Wako甘油三酯分析套組分析甘油三酯含量。(在單因子ANOVA中，相對於媒劑，*p<0.05)
    圖2係顯示經12天治療之ob/ob小鼠中FGF21-WT-R154C-PEG及FGF21-V76-154C-PEG之血漿暴露的圖示。在0 h時間點後第1天、第4天、第8天及第11天經皮下給予FGF21-WT-R154C-PEG及FGF21-V76-154C-PEG。
    圖3A及3B顯示野生型FGF21(3.7 nM)(圖A)及FGF21-V76-154C-PEG(11.1 nM)(圖B)之ob/ob小鼠血漿穩定性。野生型FGF21試樣對pERK活性(「背景活性」)之平均血漿貢獻係28%(12-49%範圍)，且FGF21-V76-154C-PEG試樣係58%(46-75%範圍)。
    (無元件符號說明)
    权利要求:
    Claims (24)
    [1] 一種多肽變體，其具有選自表1中之序列之群之序列。
    [2] 如請求項1之變體，其中該變體進一步包含以下修飾中之一或多者：(a)不超過8個胺基酸殘基之胺基端截短；及(b)不超過12個胺基酸殘基之羧基端截短。
    [3] 如請求項1之變體，其中該變體共價連接至聚乙二醇(PEG)或多唾液酸。
    [4] 如請求項3之變體，其中該變體進一步包含共價連接至該變體之半胱胺酸之40 kDa具支鏈PEG基團。
    [5] 如請求項1之變體，其中該變體融合至由以下中之一者組成之異源胺基酸序列：IgG恆定結構域或其片段、人類血清白蛋白(HSA)及白蛋白結合多肽。
    [6] 如請求項5之變體，其中該異源胺基酸序列融合至該變體之胺基端。
    [7] 如請求項5之變體，其中該異源胺基酸序列融合至該變體之羧基端。
    [8] 一種多聚體，其由至少一種如請求項1之變體組成。
    [9] 如請求項8之多聚體，其中該多聚體係同源二聚體。
    [10] 一種多肽或蛋白質變體，其包含變體76(V76)。
    [11] 如請求項10之變體，其中該變體在154位半胱胺酸殘基處經聚乙二醇化。
    [12] 如請求項11之變體，其中該變體在154位進一步包含40 kDa具支鏈PEG基團。
    [13] 一種醫藥組合物，其包含選自由表1中之序列組成之群之變體。
    [14] 如請求項13之醫藥組合物，其進一步包含在154位半胱胺酸殘基處經聚乙二醇化之變體76(V76)。
    [15] 一種成纖維細胞生長因子21(FGF21)多肽或蛋白質變體之用途，其用於製造用以治療FGF21相關病症之藥劑。
    [16] 如請求項15之用途，其中該FGF21相關病症由以下中之一或多者組成：肥胖症、1型及2型糖尿病、胰腺炎、異常血脂症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症候群及其他代謝障礙。
    [17] 如請求項16之用途，其中該FGF21相關病症由1型糖尿病組成。
    [18] 如請求項16之用途，其中該FGF21相關病症由2型糖尿病組成。
    [19] 一種成纖維細胞生長因子21(FGF21)多肽或蛋白質變體之用途，其用於製造用以治療FGF21相關病症之藥劑，其中該變體進一步包含在154位半胱胺酸殘基處經聚乙二醇化之變體76(V76)。
    [20] 如請求項19之用途，其中該FGF21相關病症由以下中之一或多者組成：肥胖症、1型及2型糖尿病、胰腺炎、異常血脂症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰島素抗性、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症候群及其他代謝障礙。
    [21] 如請求項20之用途，其中該FGF21相關病症由1型糖尿病組成。
    [22] 如請求項20之方法，其中該FGF21相關病症由2型糖尿病組成。
    [23] 一種成纖維細胞生長因子21(FGF21)多肽或蛋白質變體之用途，其用於製造用以降低高血糖症、高胰島素血症、肝脂質或體重增加之藥劑。
    [24] 如請求項23之用途，其中該變體進一步包含在154位半胱胺酸殘基處經聚乙二醇化之變體76(V76)。
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US41547610P| true| 2010-11-19|2010-11-19||
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